基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，具体步骤为：制备骨髓悬液；取患者外周血，置于血袋中；制备自体血清；得到目的细胞；取15ml DMEM高糖培养基加入到目的细胞内，接种于T25细胞培养瓶中，置于培养箱中培养；用PBS液轻洗细胞两次；向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；得到清洗后的沉淀；将细胞接种于细胞培养瓶内继续培养；细胞传代3次；向培养瓶内加入胰蛋白酶‑EDTA溶液；用PBS洗涤细胞3次；重悬细胞；取一个无菌猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜，放置于无菌塑料培养皿中，用高糖DMEM培养基浸泡过夜；将细胞悬液滴入猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜上，培养3天。本发明专利技术具有治疗精确度高等优点。

Method for preparing matrix induced autologous bone marrow mesenchymal stem cell composite scaffold

The invention discloses a preparation method of autologous bone marrow mesenchymal stem cells induced by composite scaffold, which comprises the following steps: preparation of bone marrow suspension; patients in peripheral blood in the blood bag; preparation of autologous serum; obtained cell; 15ml DMEM high glucose medium added to the target cells in the inoculated T25 cell culture bottle, placed in the incubator; washing the cells two times with PBS light liquid; to culture bottle drops in high glucose DMEM medium terminated digestion; get cleaned after precipitation; the cells were seeded in culture flask and cultured cells; cells of passage 3 were added to the culture of pancreas; protease EDTA solution in the bottle; washing the cells with PBS 3; cell suspension; a sterile porcine I / III collagen membrane, placed in sterile plastic petri dishes, soaked overnight in high glucose DMEM culture medium; cell suspension was dropped into the swine Type I / type III collagen membrane was cultured for 3 days. The invention has the advantages of high treatment precision, etc..

【技术实现步骤摘要】
基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法
本专利技术涉及组织工程关节软骨损伤修复治疗领域，具体来说是一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法。
技术介绍
关节软骨损伤在临床上是一种常见的疾病，临床表现为关节疼痛，负重、运动则加重，限制了患处关节的活动,多发病于运动员、年老者,由于关节软骨是透明软骨，缺乏血管、淋巴、神经营养等，因此很难自我修复,一旦发病，则往往发展为骨性关节炎，重者需要人工关节置换。这一疾病的治疗以前有过多种治疗手段，包括清创术、骨髓刺激术（如微骨折术、软骨下骨钻孔术等）、自体或异体软骨膜和骨膜移植术、骨软骨移植术、关节软骨移植术等,但这些技术修复组织多以纤维软骨为主、缺乏正常透明软骨的力学性能及耐用性，同时也常常会出现一些并发症如修复后过度生长、骨膜增生、关节肥大、损坏正常组织、疾病传染等。随着自体软骨细胞移植技术（Autologouschondrocyteimplantation,ACI）的成熟，软骨损伤修复治疗逐渐进入组织工程修复领域,第一代ACI技术多采用自体骨膜瓣，易形成骨膜肥大，骨膜增生伸入关节腔往往需要二次手术切除,移植的骨膜也使软骨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，其特征在于：具体步骤为：（1）、在无菌条件下，使用20ml的注射器，将1ml肝素钠生理盐水抽吸入注射器内，然后继续使用注射器抽入骨髓9ml，去掉针头后，将肝素钠生理盐水和骨髓加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混合均匀后，得到骨髓悬液；（2）、在无菌条件下，取患者外周血100‑200ml，置于血袋中，密封；（3）、将患者的外周血分装于50ml离心管中，每管45ml,在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；（4）、将...

【技术特征摘要】
1.一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，其特征在于：具体步骤为：（1）、在无菌条件下，使用20ml的注射器，将1ml肝素钠生理盐水抽吸入注射器内，然后继续使用注射器抽入骨髓9ml，去掉针头后，将肝素钠生理盐水和骨髓加入含10mlDMEM高糖培养基的培养瓶中，混合均匀后，得到骨髓悬液；（2）、在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封；（3）、将患者的外周血分装于50ml离心管中，每管45ml,在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；（4）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，离心20min，然后吸取中间白膜层，然后向白膜层内加入50mlPBS，并吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50mlPBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；（5）、向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，然后取15ml含自体血清和硫酸庆大霉素的DMEM高糖培养基加入到目的细胞内，然后将细胞吹打均匀，并计数，以5×105/cm2接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基也含10%自体血清和40U/ml硫酸庆大霉素；（6）、细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-EDTA溶液，胰蛋白酶-EDTA溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-EDTA溶液中的EDTA的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于37℃，5%的CO2温箱2-3min后，倒置在显微镜下，观察到细胞回缩、细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入5ml高糖DMEM培养基终止消化；（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞从瓶壁上脱落，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖DMEM培养基，离心7min，去上清后，重...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦玉军，李航，陆宝石，苏军，吴远航，
申请(专利权)人：安徽安龙基因医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34