一种双向伯克霍尔德氏菌及其复合生物制剂的制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种双向伯克霍尔德氏菌，该菌种分类命名为双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)，已于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏编号为CGMCC No.13140；进一步地，本发明专利技术还提供包括该菌株发酵菌剂与5％苦参碱组成的复合生物制剂。本申请的菌株来源于健康果实表面，属于天然的植物生防菌，更加安全，且作为生物防治时更有利于定殖植物叶片和果实的表面，能够起到长效的防治。同时，本发明专利技术选用植物源的苦参碱与其菌剂复合组成强效生物制剂，相比于单一的微生物制剂，混合生物制剂的抑菌谱更广，且兼容了苦参碱速效防治效果和微生物制剂长效防治的特点，抑菌效果显著提高。

Preparation and application of bidirectional Burke Holder bacteria and composite biological preparation thereof

The invention relates to a bidirectional Burke Holder's bacteria, the species named bidirectional Burke Holder's bacteria (Burkholderia ambifaria) in October 24, 2016, has been preserved in general biological center Chinese microbe preservation management committee, the preservation number is CGMCC No.13140; furthermore, the invention also provides a composite biological preparation of the strain fermentation with 5% Matrine composition. The application of the strains from healthy fruit surface, which belongs to the natural plant biocontrol agents, more secure, and as a biological control is more conducive to the surface colonization of plant leaf and fruit, can play a long-term control. At the same time, with compound matrine agent potent biological agents of the invention is made of plant source, compared to the single mixed microbial agents, antibacterial biological agents has a broader spectrum, and is compatible with the characteristics of matrine available microbial preparation control effect and long-term prevention, antibacterial effect significantly improved.

【技术实现步骤摘要】
一种双向伯克霍尔德氏菌及其复合生物制剂的制备及应用
本专利技术涉及微生物领域，特别是涉及一种双向伯克霍尔德氏菌及其复合生物制剂的制备及应用。技术背景目前对伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的研究已较多，主要集中在应用该属内的菌株产生酶或用于治理环境污染，如以下专利文献：公开号1195373(日本，中山美香等，公开日2004/03/24)的降解卤代烃的微生物及应用；公开号1484703(日本，早出广司，公开日2004/03/24)的葡萄糖脱氢酶和生产该脱氢酶的方法；公开号1867676(日本，山口将宪等，公开日2006/11/22)的鲨肌醇的制备方法；公开号101198695(德国，贝赛林等，公开日2008/06/11)的生产脂肪酶的方法；公开号101153272(中国，盛下放等，公开日2008/04/02)的一种铅镉抗性细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法；公开号102046778A(日本，古贺一治、增田绅吾，公开日2011/05/04)的降低植物体中的重金属含量的细菌；公开号101671636(中国，郭军康等，公开日2010/03/17)的一种抗重金属植物促生菌制剂及其施用方法。但以上文献都没有涉及到植物病原菌生物防治的相关应用。在植物病害的生物防治方面，任嘉红等发现吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对杨树溃疡病具有防治效果(任嘉红等，吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007抗菌蛋白的分离纯化，微生物学通报，2010-06-20；任嘉红等，吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的发酵条件及其对杨树溃疡病的防治效果，中国生物防治，2010-08-08；叶建仁等，一种吡咯伯克霍尔德氏菌及其在防治杨树溃疡病中的应用，中国专利，2009-10-14；)；查传勇发现双向伯克霍尔德氏菌Lu10-1能够产生抗菌活性物质(查传勇等，双向伯克霍尔德氏菌Lu10-1产生抗菌活性物质的发酵培养基和发酵条件优化，蚕业科学，2009-06-15)；林善海等发现伯克霍尔德氏菌对香蕉褐缘灰斑病具有防治效果(林善海等，拮抗伯克霍尔德氏菌对香蕉褐缘灰斑病的生物防治试验，中国植物病理学会2007年学术年会论文集，2007-08-01)。此外，本申请的申请人多年来对伯克霍尔德氏菌研究较为深入，例如申请人本人于2013年7月30日申请了相关专利201310326671.2，其中涉及保藏编号为CCTCCNO:M2013145；该菌株是申请人发现的双向伯克霍尔德氏菌一代菌株，尽管其发酵物在防治病原真菌或病原细菌类病害具有一定的效果，然而申请人仍希望分离或筛选出更优良的菌株，以及采用更有效的方法培养出抗菌效果更优的抗菌剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对植物病原真菌引起的植物病害提供一种生防菌株，以及在该菌株基础上制备高效的复合生物制剂的方法，以及相应的复合生物制剂产品。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：一种双向伯克霍尔德氏菌，其特征在于，该菌种分类命名为双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaambifaria)，已于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，其地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.13140。本专利技术所涉及的上述双向伯克霍尔德氏菌菌株的16SrDNA序列如附件所示。进一步地，本专利技术提供上述双向伯克霍尔德氏菌在制备防治植物病原真菌引起的植物病害抗菌剂中的应用。所述植物病原真菌为核桃炭疽病菌(Glieosporiumrugonmculans(Berk)Thtim)、油菜菌核(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)、草莓灰霉(StrawberryGrayMould)、小麦赤霉(FusaHumgraminearumSehw)、番茄灰霉(Botrytiscinerea)。进一步地，本专利技术提供一种制备植物病害抗菌剂的方法，其特征在于，该方法在于将所述双向伯克霍尔德氏菌接入改进的LB液体培养基中发酵培养，其特征在于培养条件如下：按照5％的接种量，将24～36h菌龄的种子接种于装有100mLLB液体发酵液的500mL三角瓶中，以180r/min在25℃条件下培养36h；所述改进LB培养基配方为(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨15、牛肉膏5、硫酸镁0.5、氯化钠1、磷酸氢二钾5、水1L，pH7.0～7.2。发酵结束后通过离心或者板框过滤获得微生物菌体，然后使用硅藻土吸附来制备菌剂，所述微生物菌体与硅藻土的体积比为1:5-10。优选地，微生物菌体与硅藻土二者的体积比为1:6。进一步地，本专利技术提供一种新型复合生物制剂，其特征在于，所述复合生物制剂包括上述抗菌剂与5％的苦参碱混合；二者的重量比为2:1-1:3。优选地，二者的重量比为1:2。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1、相比在先专利201310326671.2，本专利涉及的生防菌CGMCCNo.13140分离于健康果实表面，属于植物表面定殖的益生菌，作为生防菌更加安全可靠；2、菌株CGMCCNo.13140来源于健康植物表面，因此，该菌株作为生防菌在防治过程中更易定殖于果实和植株表面，能够起到长效防治的效果；3、本专利选用植物源的苦参碱与其菌剂复合组成强效生物制剂，相比于单一的微生物制剂，混合生物制剂的抑菌谱更广，且兼容了苦参碱速效防治效果和微生物制剂长效防治的特点，抑菌效果显著提高。本复合生物制剂对番茄灰霉的抑制率为92.45％，对核桃炭疽病菌的抑制率为85％，对油菜菌核的防效为83％，对草莓灰霉的室内生防效果也达78％，此外，对小麦赤霉、香蕉炭疽病、荔枝霜疫霉病等均具有良好的防效；4、相比在先专利201310326671.2中所涉及到的保藏编号为CCTCCNO:M2013145的双向伯克霍尔德氏菌而言，二者的来源不同，在先专利从土壤中分离；此外二者能有效防治的对象也不同，本专利技术所分离的菌株具有更好的应用前景。附图说明：图1：生防菌伯克霍尔德氏菌菌落形态照片图2：生防菌伯克霍尔德氏菌显微照片图3：生防菌伯克霍尔德氏菌16SrRNA测序序列图4：生防菌伯克霍尔德氏菌的进化树图5：生防菌伯克霍尔德氏菌对多种植物病原真菌的抑制图6：生防菌伯克霍尔德氏菌剂对番茄灰霉的抑制图7：生防菌剂与苦参碱组成复合生物制剂与单纯菌剂对番茄灰霉的平板抑制比较图8：生防菌剂与苦参碱组成的复合生物制剂对番茄灰霉的抑制的植物离体实验具体实施方式实施例1：保藏编号为CGMCCNo.13140的特定双向伯克霍尔德氏菌菌株的筛选及鉴定1、菌株的筛选(1)果实样品的采集以陕西省洛川县为基地，选择树龄较小的苹果示范园，挑选树势旺盛的植株，选取健康苹果采摘，用无菌袋装好后带回实验备用。(2)植物表面微生物富集将新鲜采集的苹果，在超净工作台里用无菌水清洗表面，将清洗表面的水加入LB液体培养基中，37℃，200rpm，富集培养48h。然后将富集好的发酵液逐级稀释，分别选择10-2,10-4,10-5稀释液作为分离源。(3)分离方法吸取100μL稀释液到预先倒好的营养琼脂培养基的90mm培养皿中，用灭菌的玻璃刮刀涂布均匀，待晾干，作好标记和日期，培养皿倒置，培养温度37℃，培养时间24h，将平板上长出的单菌落挑出后到新的培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株双向伯克霍尔德氏菌，其特征在于，该菌种被分类命名为双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)，已于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏编号为CGMCC No.13140。

【技术特征摘要】
1.一株双向伯克霍尔德氏菌，其特征在于，该菌种被分类命名为双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaambifaria)，已于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13140。2.根据权利要求1所述的双向伯克霍尔德氏菌，其特征在于，该菌株的16SrDNA序列如附件所示。3.根据权利要求1所述的双向伯克霍尔德氏菌能作为生防菌在防治多种植物病原真菌引起的植物病害中得到应用。4.根据权利要求3所述的应用，所述植物病原真菌为核桃炭疽病菌、油菜菌核、草莓灰霉、小麦赤霉病、番茄灰霉、香蕉炭疽病、荔枝霜疫霉病等。5.一种制备植物病害抗菌剂的方法，其特征在于，将权利要求1所述的双向伯克霍尔德氏菌接入改进LB液体培养基中发酵培养，其特征培养条件如下：按照5％的...

【专利技术属性】
技术研发人员：高增毅，段康民，
申请(专利权)人：西安西诺农化有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61