本发明专利技术公开了一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株，其分类命名为代尔夫特菌(Delftia sp.)，菌株号为WL‑3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017136，保藏日期为2017年3月21日。本发明专利技术还公开了上述菌株在降解土壤中对苯二甲酸二乙酯的应用。菌株WL‑3为好氧型微生物，最适生长温度为30℃，最适生长pH为7.0。菌株WL‑3在7天内可以完全降解1000mg/L的对苯二甲酸二乙酯，并利用其作为唯一碳源生长，可以完全降解其代谢产物对苯二甲酸。本发明专利技术对于对苯二甲酸二乙酯的降解以及对其代谢产物在工业废水的生物治理上具有重要的应用价值。
Strain for degrading terephthalic acid two ethyl ester and application thereof
The invention discloses a degradation of terephthalic acid ethyl ester two strains, the classification named Delft strain (Delftia sp.), WL strain No. 3, has been preserved in Chinese type culture collection center, the preservation number is: CCTCC NO:M 2017136, the collection date is March 21, 2017. The invention also discloses the application of the strain in the degradation of terephthalic acid two ethyl ester in soil. Strain WL 3 aerobic microorganisms, the optimum growth temperature of 30 DEG C, the optimum concentration of pH is 7. Strain WL 3 in 7 days can terephthalate complete degradation of 1000mg/L two, and use it as the sole carbon source for growth, can degrade the metabolites of terephthalic acid. The invention has important application value for the degradation of terephthalic acid two ethyl ester and the biological treatment of the metabolic products of the terephthalic acid in the industrial wastewater.
【技术实现步骤摘要】
一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株及其应用
本专利技术属于生物处理
，涉及一株高效降解对苯二甲酸二乙酯的菌株及应用。
技术介绍
首先随着聚酯塑料(PET)产业的快速发展和广泛应用，每年都会产生大量的PET废弃物。我国每年约有400kt的聚酯废料产生，虽然这些聚酯废料本身毒性不大，不会直接对环境造成危害，但由于其废弃物数目巨大，而且很难在自然条件下降解，造成了极大地白色污染。由于PET具有疏水性和高结晶度，要直接从PET着手筛选到能高效降解的微生物或酶非常困难。所以本实验以对苯二甲酸二乙酯(DET)作为结构模拟物来驯化和培养PET的降解菌。首先，对苯二甲酸二乙酯作为化工原料自身是一种环境荷尔蒙，对环境会产生严重污染。其次，对苯二甲酸二乙酯在微生物和水解酶的作用下将释放出对苯二甲酸(TPA)，是一种非常重要的化工原料，广泛应用于合成树脂、涤纶纤维、塑料薄膜和染料等行业，但对水中微生物的再生有抑制作用，对动物有致突性和致癌作用，被公认为是一种有毒害性的污染物。目前对苯二甲酸的生物降解研究较多，但对苯二甲酸二乙酯的处理工艺还很不完善。张建飞等人从对有降解作用的混合菌悬液中分离出5株纯种菌，并从中筛选出对DTP降解作用最好的菌株F4，降解5000ppm的对苯二甲酸二乙酯，14天后的降解率可超过92％。研究苯二甲酸二乙酯的生物降解规律，不仅可以解决化工原料本身对环境的污染问题，还可以为PET的生物降解研究奠定良好的基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对PET生物降解对苯二甲酸二乙酯和工业废水中对苯二甲酸的生物治理，提供一种高效降解对苯二甲酸二乙酯的微生物。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株，其分类命名为代尔夫特菌(Delftiasp.)，菌株号为WL-3，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2017136，保藏日期为2017年3月21日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。该菌株是专利技术人于2016年11月筛选出来的。本专利技术所述的DelftiaWL-3筛选方法：在以对苯二甲酸二乙酯为唯一碳源的无机盐养基(pH7.0)中，对含苯系物及其衍生物的工业废水中的对苯二甲酸二乙酯(DET)降解菌株进行分离筛选。具体地，以含苯系物及其衍生物的工业废水作为筛选目标，利用含1000mg/L对苯二甲酸二乙酯的无机盐培养基作为介质，连续富集驯化具有对苯二甲酸二乙酯利用能力的菌株，将无机盐培养基稀释涂布于含有1000mg/L对苯二甲酸二乙酯的无机盐固体培养基，30℃培养2-3d，挑取形态不同的对苯二甲酸二乙酯降解菌株进行划线分离获得纯培养，命名为菌株WL-3，再次验证纯种微生物菌株WL-3对对苯二甲酸二乙酯降解能力，利用高效液相色谱检测对苯二甲酸二乙酯残余含量；具体地，所述的无机盐培养基是由硝酸铵1.0g，氯化钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，加水至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121℃灭菌15min，使用前添加终浓度1000mg/L的对苯二甲酸二乙酯作为碳源。WL-3菌株于30℃培养箱培养24h后，菌落乳白色，呈隆起、圆形、不透明状。WL-3菌株淀粉水解反应呈阴性、接触酶反应呈阳性、脲酶反应呈阳性、V-P反应阳性、甲基红反应阳性、氧化酶反应阳性、明胶液化反应阳性。菌株WL-3的生理生化鉴定结果与代尔夫特菌的特征最为接近。具体地，所述的1/3LB培养基是由蛋白胨3.0g，酵母粉1.5g，氯化钠3.0g，加水至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂20.0g、121℃灭菌15min。本专利技术所述的菌株WL-3，其16SrDNA的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。一种含有本专利技术所述的对苯二甲酸二乙酯及其代谢产物降解菌株DelftiaWL-316SrDNA序列的克隆载体。所述的重组克隆载体，优选出发载体为pMD19T。含所述的对苯二甲酸二乙酯及其代谢产物降解菌株DeftiaWL-316SrDNA序列的基因工程菌EscherichcoliDH5α(pMD19T-16S)。所述的基因工程菌EscherichcoliDH5α构建方法：利用引物27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`和1492R：5`-TACCTTGTTACGACTT-3`扩增菌株WL-3的16SrDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌EscherichcoliDH5α获得重组微生物EscherichcoliDH5α(pMD19T-16S)，将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16SrDNA序列，在分子水平上将菌株WL-3鉴定至代尔夫特菌属。上述菌株WL-3在降解废水中对苯二甲酸二乙酯中的应用也在本专利技术的保护范围之内。其中，对苯二甲酸二乙酯在废水中的浓度优选范围是250mg/L～1000mg/L。一株对苯二甲酸二乙酯降解菌株DelftiaWL-3在废水处理过程中的应用，具体步骤如下：(1)菌株WL-3种子液培养：菌株WL-3种子液采用LB液体培养基，取试管斜面保藏的菌株WL-3，用接种环挑去菌落接入含有100mLLB液体培养基的三角瓶，30℃振荡培养12小时，摇床转速200r·min-1，获得的菌体经无机盐培养基洗涤两次后，制成OD600nm＝1.0的菌悬液作为降解试验种子液；(2)菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的动力学：在对苯二甲酸二乙酯终浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，按5％接种量接入种子液，于30℃，180r·min-1震荡培养，每隔1d取样一次，测定OD600nm和对苯二甲酸二乙酯的残留浓度。(3)温度和pH对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响：在对苯二甲酸二乙酯终浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，按5％接种量接入种子液，分别于20℃、25℃、30℃、37℃、42℃，pH7.0，180r·min-1震荡培养；分别于初始pH4.0、6.0、6.5.、7.0、7.5、8、9、10，30℃、180r·min-1震荡培养，测定温度和pH对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响。(4)底物初始浓度和接种量对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响：在对苯二甲酸二乙酯终浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，分别按1％、3％、5％、10％的接种量接入种子液于30℃，180r·min-1震荡培养；分别在对苯二甲酸二乙酯终浓度为250mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L的无机盐培养基中，按5％接种量接入种子液，于30℃，180r·min-1震荡培养，测定底物初始浓度和接种量对菌株WL-3降解对苯二甲酸二乙酯的影响。(5)菌株WL-3对对苯二甲酸的降解能力测定：分别在终浓度为2000mg/L的含对苯二甲酸的无机盐培养基中，按5％接种量接入种子液，于30℃，200r·min-1震荡培养，测定菌株WL-3对对苯二甲酸的降解能力。有益效果：本专利技术以化工废水为分离材料，分离纯化到一株可以高效降解对苯二甲酸二乙酯及其代谢产物的微生物，对PET生物降解和工业废水的净化非常具本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株，其分类命名为代尔夫特菌(Delftia sp.)，菌株号为WL‑3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017136，保藏日期为2017年3月21日。
【技术特征摘要】
1.一株降解对苯二甲酸二乙酯的菌株，其分类命名为代尔夫特菌(Delftiasp.)，菌株号为WL-3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2017136，保藏日期为...
【专利技术属性】
技术研发人员：董维亮，刘嘉唯，信丰学，马江锋，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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