用于蛋白质衍生和缀合的活化的唾液酸衍生物制造技术

合成了ＰＳＡ衍生物，其中还原和／或非还原端的末端唾液酸被转化为Ｎ－羟基琥珀酰亚胺酯（ＮＨＳ）基团。所述衍生物可以与例如含有胺基或肼基团的底物反应，形成未交联／交联的聚唾液酸化合物。所述底物可以例如是有治疗用途的药物、肽或蛋白质或药物送递系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于蛋白质衍生和缀合的活化的唾液酸衍生物本专利技术涉及到化合物如聚唾液酸的衍生物，该衍生物具有末端唾液 酸单元，且优选地基本只由唾液酸单元组成，在还原或非还原端有能与底物反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基团，本专利技术也涉及到生产这 些衍生物的方法。这些衍生物用于缀合含胺基基团的底物，如肽、蛋白 质、药物、药物送递系统(如脂质体)、病毒、细胞(如动物细胞)、 微生物、合成聚合物或共聚物等。聚唾液酸(PSA)是由某些细菌菌林和哺乳动物某些细胞产生的天 然存在的无支链的唾液酸聚合物。通过用神经氨 酸酶进行有限的酸水解、消化作用或是通过分级分离天然的、细菌的或 细胞来源形式的聚合物，可以产生各种聚合度的聚唾液酸从n-约80 或更多个唾液酸残基，^氐至n-2。不同PSA的组成也各异，所以存在同 聚形式即oc-2，8-连接PSA，包括大肠杆菌(Aco7/) Kl菌林和B群脑 膜炎球菌(meningococci)的荚膜多糖，它也存在于胚胎形式的神经细 胞粘连分子(N-CAM)中。也存在杂聚形式，如大肠杆菌K92菌林的oc -2, 8 a-2， 9交替连接的PSA和脑膜炎奈瑟氏菌(义迈e/7/z^/〃cr/》的C 群多糖。此外，唾液酸也存在于与非唾液酸单体(如脑膜炎奈瑟氏菌的 W135群或Y群)形成的交替共聚物中。PSA具有重要的生物学功能包括 病原菌对免疫和补体系统的逃逸，以及胎儿发育过程中对未成熟神经元 的神经胶质粘连性的调控(其中该聚合物具有抗粘连的功能) ，但在哺乳动物中没有已知的PSA受体。大肠杆 菌Kl菌抹的a-2，8-连接PSA也称为'多聚乙酰神经氨酸，(colominic acid)并且用于(以各种长度)阐述本专利技术。在细菌多糖中，甚至当缀合到免疫原性载体蛋白时，PSA的a-2，8-连接形式也是独特地非免疫原性的(在哺乳动物受试者中既不引起T细 胞应答也不引起抗体应答)，这种缀合形式可能反映了其作为哺乳动物 (以及细菌)聚合物的存在。较短形式的聚合物(最高到n=4)存在于 细胞表面神经节苷脂上，广泛分布于身体中，并且被认为有效地加强和 维持了 PSA的免疫耐受性。近些年，PSA的生物学性质，特别是(1-2,8-连接的同聚PSA的生物学性质，被用于改变蛋白质和低分子量药物分子 的药代动力学性质。许多治疗型蛋白包括过氧化氲酶和 天冬酰胺酶的PSA衍生化 使循环半衰期和它们的稳定性得到了显著的提高，并且使得在应用这些 蛋白质时不用考虑已经存在的抗体，这些抗体是先前暴露于该治疗型蛋 白而产生的一种不需要的(而且有时是不可避免的)结果。在许多方面，聚唾液酸化蛋白的l奮饰后的性 质同聚乙二醇(PEG)衍生蛋白相近。例如，在所有情况下，半衰期都 增加了，而且蛋白质和肽对于蛋白水解消化作用更加稳定，但是PSA对 生物活性的《呆持似乎比PEG更强。而 且，PEG用于必须长期给药的治疗药剂中时存在问题，因为PEG生物降 解非常緩慢而且其高和低分子量形式都倾向 于在组织内蓄积。尽管PEG作为与治 疗剂缀合的肠道外给药的聚合物有着成熟的历史，还需要对其免疫毒理 学、药理学和代谢有更好的理解。同样的，在要求高给药量的治疗药剂中应用PEG(因此最终导致 高剂量的PEG)也存在顾虑，因为PEG的蓄积会导致毒性。因而a-2，8-连接PSA成为了使人关注的 PEG替代物，它作为人体的天然部分是免疫 系统"不可见"的生物可降解聚合物，而且可由组织神经氨酸酶降解为 唾液酸，而唾液酸是一种无毒的糖类。在前面的科学论文和已获得授权的专利中，我们小组已经描述了利 用天然的PSA来改进蛋白质治疗剂的药代动力学性质。现在， 我们描述的是新的PSA衍生物，这提供了 PSA衍生蛋白(和其它形式的 治疗药剂)的新组成和新生产方法。这些新材料和方法特别适合于生产 用于人类和动物的PSA衍生治疗药剂，对于人类和动物，由于医学伦理学和监管部门(如FDA, EMEA)的安全性要求，使得药物个体的化学和分子定义非常重要。前面已经描述了将多糖联接到治疗药剂如蛋白质上的方法 。这 些方法中有一些是依靠聚合物非还原端的化学衍生化来产生蛋白质反 应活性醛基部分(附图说明图1) 。 PSA(和其它多糖)的还原端在温和条件下与 蛋白只具有弱反应活性，该温和条件是在缀合过程中维持蛋白质构象和 PSA的化学完整性所必需的。含有邻二醇的唾液酸末端单元的非还原端 可以容易地(且选择性地)被高碘酸盐氧化而生成单醛衍生物。这种衍 生物与蛋白质的反应活性更高，并且含有反应性适宜的元件，适于通过 还原性氨基化和其他化学作用蛋白质连接。我们已经在以前的 US-A-5846, 951和WO-A-0187922中对此进行了描述。这一反应在图1中进行了阐述，其中a) 显示了末端唾液酸的非还原端用高碘酸钠氧化CA (源自大肠杆 菌的a-2，8-连接PSA)生成一个蛋白质反应活性醛基之后，醛基与蛋白 质的一个伯胺基团之间的反应，和b) 显示了用氰基硼氢化钠选择性地还原希夫碱，从而与蛋白质氨 基基团生成一个稳定的不可逆的共价键。在W02005/016973中，我们描述了具有由末端唾液酸单元引入的巯 基反应活性基团的多糖衍生物。末端唾液酸单元通常是在多糖的非还原 端由唾液酸单元的衍生化引入的。巯基反应活性基团优选地为马来酰亚 胺基团。引入这一基团的反应可以包括在一端具有巯基反应活性基团和 另一端具有如酰肼或酯基团的异双功能试剂与一个醛基或一个胺基基 团之间的反应，该醛或胺基基团位于多糖的唾液酸衍生末端单元上。产 物可用于蛋白的定位衍生作用，例如在Cys单元或引入的巯基基团位置 衍生。尽管已经描述的各种将PSA连接到治疗药剂上的方法 在理论上是可行的，但是为使蛋白与 PSA非还原端(以醛的形式)反应生成的缀合物达到可接受的产量，所 要求的反应时间在较高温度下将不利于蛋白质的稳定性(例如，干扰素 a-2b)。其次，所需的反应物浓度(即聚合物过量)可能难以实现或 不够经济。 因此，我们通过开发出一种新的方法解决了上述问题，这种方法用于将在还原和/或非还原末端带有NHS-唾液酸基团的聚唾液酸缀合至蛋 白质。还原端的弱反应活性可以被用来产生有益的效果(通过破坏非还 原端，帽化还原端和用双功能交联剂衍生)，因而避免了使用已经建立 的方法(图1)所导致的图2和3所描述的产物复杂性，图l的方法是 用高碘酸盐氧化的CA来还原性氨基化蛋白质。Jennings and Lugowski，在US 4， 356，170中，描述了通过活化的 还原末端单元用蛋白质来^f生细菌多糖，包括开始的还原步骤和随后的 氧化步骤。Jennings等采用了这一方法的实例包括还原性末端单元是 N-乙酰基甘露糖胺的多糖、葡萄糖、葡萄糖胺、鼠李糖和核糖。在EP-A-0454898中将蛋白质的氨基基团连接到醛基基团上，该醛 基是通过还原和部分氧化葡糖胺聚糖还原性末端的糖部分合成的。以这 种方式处理的葡糖胺聚糖包括透明质酸、硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素 和疏酸皮肤素。这些化合物在还原末端都没有唾液酸单元。本专利技术提供了一种新型的化合物，包括至少一个末端单元是衍生自 唾液酸单元的一种聚唾液酸底物，所述唾液酸单元包含在2或7位碳上 连接到末端单元的N-羟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化合物，包括至少一个末端单元是衍生自一个唾液酸单元的一种聚唾液酸（ＰＳＡ）底物，所述唾液酸单元包括在它的２或７位碳原子上连接的Ｎ－羟基琥珀酰亚胺酯，任选地通过接头连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S杰因，I帕佩奥安诺，S索伯翰尼，
申请(专利权)人：利普生技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]