带电多糖的分级制造技术

将多分散并带电的多糖分级为具有低的多分散系数的级分（优选ｐｄ＜１．１），每个级分含有分子量分布狭窄的种类。将多分散多糖的水溶液与柱中的离子交换树脂接触，然后用水性缓冲洗脱液对多糖进行选择性洗脱。选择性洗脱过程包括依次使用至少三种各自具有不同的且恒定的离子强度和／或ｐＨ的缓冲洗脱液，并且后一种缓冲液与之前的缓冲液相比具有较高的离子强度和／或ｐＨ。这种新的制备方法特别适用于生产拟用于人类和动物的ＰＳＡ衍生治疗剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及将任选具有活性基团的多分散的带电多糖分级为低多分散系数(pd)的级分(优选pd＜1.1)。分级的多糖可用于缀合连接底物——例如肽、蛋白质、药物、药物传递系统(例如脂质体)、病毒、细胞(例如动物细胞、微生物、合成聚合物等)，或者在药用组合物中用作赋形剂或稀释剂。聚唾液酸(PSA)是唾液酸的天然存在的非支链聚合物形式，由某些细菌菌株和哺乳动物的某些细胞产生。产生的PSA可为多种聚合度从n＝约80或更多唾液酸残基低至n＝2，可由有限的酸水解、神经氨酸酶的消化作用或由来源于细菌或细胞的天然形式的聚合物分级而产生。不同的PSA的组成也彼此存在差异，存在I.均聚物形式，即α-2，8连接的PSA，包括大肠杆菌菌株K1和B组脑膜炎球菌的荚膜多糖，该形式也存在于神经细胞黏附分子(N-CAM)的胚胎形式中。II.杂聚物形式，例如大肠杆菌菌株K92的交替α-2，8α-2，9PSA和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的C组多糖。此外，还有III.交替共聚物，含有不同于唾液酸的唾液酸单体，例如脑膜炎奈瑟菌的W135组和Y组。PSA具有重要的生物学功能，包括使免疫系统和补体系统避免致病细菌，以及调节胎儿发育过程中未成熟神经元的神经胶质的黏着性(其中该聚合物具有抗黏着作用)。哺乳动物体内没有已知的PSA受体。大肠杆菌菌株K1的α-2，8连接的PSA也被称为“多聚乙酰神经氨酸”(CA)，并用来(为各种长度)示例性说明本专利技术。α-2，8连接形式的PSA在细菌多糖中是唯一非免疫原性的(不引起哺乳动物个体内的T细胞或抗体应答)，即使与免疫原性载体蛋白缀合时也是如此，这可以表现为其作为哺乳动物(以及细菌)聚合物存在。在广泛分布于体内的细胞表面神经节苷脂中发现了较短的聚合物(n最高为4)，并认为该较短聚合物可有效地导致并保持对PSA的免疫耐受性。近些年来，已利用了PSA的生物学特性，特别是α-2，8连接的均聚PSA的生物学特性，以改变蛋白质和低分子量药物分子的药物代谢动力学性质。包括过氧化氢酶和天冬酰胺酶在内的一些治疗性蛋白的PSA衍生物使得循环半衰期大幅度提高，并使得这些蛋白可用于应对预存抗体，所述预存抗体是由于之前暴露于治疗性蛋白而不期望(有时是不可避免)产生的。在很多方面，聚唾液酸化蛋白质的改进的性质与用聚乙二醇(PEG)衍生的蛋白质相当。例如均提高了半衰期，并且蛋白质和肽在蛋白水解消化中更稳定，但采用PSA时生物活性的保持力比PEG更强。在采用需要长期给药的治疗剂时使用PEG也存在问题，因为PEG只能非常缓慢地生物降解并且高分子量形式的PEG易于在组织中积累。已经发现PEG化的蛋白质能产生抗PEG的抗体，该抗PEG的抗体也会影响缀合物在血液循环中的停留时间。尽管PEG作为与治疗物缀合连接的肠胃外给药聚合物已有一定历史，但仍需对其免疫毒理学、药理学和代谢进行更深入的了解。同样也对PEG在需要大剂量使用的治疗剂中的应用(因此最终导致大剂量的PEG)有所担忧，因为PEG的积累可产生毒性。因此α-2，8连接的PSA成为一种引人关注的PEG替代物，其作为免疫上“不可见”的可生物降解的聚合物自然成为人体的一部分，并且可通过组织神经氨酸酶降解为无毒的糖类——唾液酸。我们小组在之前的科学论文和授权专利中记载了天然PSA在提高蛋白质治疗物的药物代谢动力学性质中的用途。这里，我们记载了新的PSA衍生物，该衍生物产生新的组合物和制造PSA衍生蛋白质(以及其它形式的治疗剂)的方法。之前已经对将多糖连接在治疗剂例如蛋白质上的方法有报导。这些方法中的某些方法依靠对聚合物的“非还原”端的化学衍生以生成对蛋白质有活性的醛部分(附图说明图1、2)。在缀合连接过程中为保持蛋白质的构象和PSA的化学完整性需要温和的条件，而PSA(以及其它多糖)还原端在这种温和条件下只具有微弱的与蛋白质反应的活性。唾液酸末端单元的非还原端含有邻位二醇，能够容易地(和选择性地)被高碘酸盐氧化生成单醛衍生物。该衍生物对蛋白质的活性高得多，并且包含可通过还原性胺化和其他化学作用连接到蛋白质上的适合的活性部分。我们之前已在US-A-5846,951和WO-A-0187922中对此有所记载。该反应在图1a和2中进行了示例说明，其中1a)显示了使用高碘酸钠氧化CA(来自大肠杆菌的α-2，8连接的PSA)以在末端唾液酸的非还原端生成对蛋白质有反应活性的醛，并且2)显示了使用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)进行席夫(Schiff)碱的选择性还原以与蛋白质氨基基团形成稳定的、不可逆的共价键。可以利用还原端的弱活性产生有益效果(通过破坏非还原端，使还原端封端并使用二官能交联剂进行衍生)，从而避免现有方法(图1a)产生图1b中所示的复杂产物，所述现有方法为使用高碘酸盐氧化的CA对蛋白质进行还原性胺化。市售聚合物(尤其是天然聚合物，例如多聚乙酰神经氨酸(CA)；在多数上述论文中采用)由细菌产生并且高度多分散。这些聚合物可能还含有细菌污染物例如内毒素、盐等。这种材料可能不适用于生产拟用于人类和动物的PSA衍生治疗剂，由于医学道德准则和管理机构(例如FDA、EMEA)的安全要求，在该治疗剂中对药物体的化学和分子上的限定非常重要。因此我们通过开发出新的将多分散多糖制剂分级为一系列低多分散性(＜1.1pd)级分的方法解决了上述问题，所述每个低多分散性级分都包含分子量分布范围狭窄的种类。这些新的制备方法特别适用于制造拟用于人类和动物的PSA衍生治疗剂，其中由于医学道德准则和管理机构(例如FDA、EMEA)的安全要求，在该治疗剂中对药物体的化学和分子上的限定非常重要。离子交换色谱法是本领域已知的用于分离复杂混合物的方法。一般来说，现有技术通过离子强度的变化达到分离目的。在完全解离的电解质溶液中，离子强度(I)定义为I＝0.5∑iCiZi2，其中Ci为特定离子的浓度，Zi为该离子种类的电荷数。Constantino等，报导了一种适用于从带负电的多糖多分散制剂中分离高分子量级分的色谱方法，所述带负电的多糖例如b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)抗原以及A组和C组脑膜炎奈瑟菌抗原。所获得的物质仍然含有分子量分布较宽的种类(即仍为高度多分散的)，但已不含小分子低聚糖。低聚糖的去除使该材料更适用于基于多糖的疫苗。低分子量种类的去除通过两步洗脱过程实现。简单来说，将带负电的多糖Hib(b型流感嗜血杆菌抗原)结合到离子交换树脂上，通过使用低离子强度的缓冲液充分冲洗将低分子量的种类洗脱。仍保留在柱上的中等分子量和高分子量的种类通过用高离子强度的缓冲液洗脱而进行回收。Zhang等(1997)报导了使用高效离子交换色谱进行多聚乙酰神经氨酸聚合物的分离。将三种母液混合以形成硝酸钠浓度逐渐升高的线性梯度。本专利技术与Constantino等和Zhang等所公开内容的区别在于使用分级梯度而不是线性梯度洗脱。Constantino等使用大量低离子强度的冲洗液从柱上去除所有低分子量的种类，然后再使用大量高离子强度的冲洗液从柱上去除全部其他种类。这种方法不能分离出低多分散性的级分。使用本专利技术的分级梯度使得能够分离为低多分散性的级分，所述分级梯度彼此仅在离子强度上有微小差别。Ravenscro本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将带离子电荷的多分散多糖分级为具有不同平均分子量的级分的方法，其中将多分散多糖的水溶液与柱中的离子交换树脂接触，然后用水性缓冲洗脱液对多糖进行选择性洗脱，并从洗脱的各级分中回收多糖，其特征在于选择性洗脱包括用至少三种缓冲洗脱液依次冲洗柱中的树脂，所述至少三种缓冲洗脱液各自具有不同的且恒定的离子强度和／或ｐＨ，并且第二种缓冲液和其后的缓冲液与相邻的前一种缓冲液相比具有较高的离子强度和／或ｐＨ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S杰因，I帕佩奥安诺，P莱恩，
申请(专利权)人：利普生技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]