具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7及其应用方法技术

本发明专利技术公开了具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7及应用方法，该菌分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016128。实验证明本发明专利技术的菌株能提高半滑舌鳎免疫机能，有效抵抗病原微生物侵袭，疾病发病率降低至4％以下，养殖成活率提高到96％以上；提高半滑舌鳎消化酶活性和饲料利用率，饵料系数降低12％以上，特定生长率提高4％以上；有效降低抗生素及化学药物使用量，减少环境污染，保障养殖产品质量安全，具有良好的生态效益。解决了制约半滑舌鳎养殖业健康发展的病害防治关键技术难题，绿色环保高效健康养殖。

【技术实现步骤摘要】
具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7及其应用方法
本专利技术属于微生物
，具体涉及具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7及应用方法。
技术介绍
半滑舌鳎是我国重要的经济名贵鱼类，肉味鲜美，具有广温、广盐和适应多变环境的特点，是理想的养殖品种之一。随着海水工厂化养殖业的发展，半滑舌鳎成为主养品种之一。长期高密度集约化养殖，导致病害发生愈来愈严重，主要病害有：溃烂病、腹水病、脾肾坏死病等，患病鱼死亡率高达70％以上，经济损失巨大，严重制约了半滑舌鳎养殖业的健康发展。传统治疗方法是使用大剂量抗生素或化学药物浸泡或口服，长期使用的结果导致了致病菌抗药性的产生，不仅没有获得良好的治疗效果，还产生了因药物残留导致的食品安全问题，受到社会各界高度关注。探索新的水产养殖经济动物疾病防治技术成为解决目前困局的有效方法和途径。疫苗免疫技术具有绿色环保高效的特点，但水产养殖环境、养殖品种及养殖模式具有多样性，致病微生物复杂多样，再加上水生动物生活在水中，疫苗免疫接种技术还未取得重大突破，生产应用还只限于局部地区或某个养殖品种的生产应用实验，还不能在水生动物疫病防控中发挥应有的重要作用。近年来，借鉴益生菌技术，筛选具有免疫促生长作用的微生物，通过优化改善水产养殖经济动物肠道菌群结构，进而提高机体免疫力，促进养殖动物健康生长成为疾病防治技术研究热点之一。已报道的研究结果表明，该项技术具有绿色环保、实用高效的优点，但还未形成可供水产养殖生产应用的技术和产品，特别是针对海珍品鱼类半滑舌鳎具有免疫促生长作用的技术产品还没有相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7。本专利技术的第二个目的是提供具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7的应用。本专利技术的技术方案概述如下：具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2016128。上述具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7的发酵液添加到饲料中的应用。本专利技术的优点：实验证明具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7能显著提高养殖半滑舌鳎免疫机能，有效抵抗病原微生物侵袭，疾病发病率显著降低至4％以下，养殖成活率显著提高到96％以上；显著提高半滑舌鳎消化酶活性，提高饲料利用率，促进生长发育，饵料系数降低12％以上，特定生长率提高4％以上，经济效益显著。该菌株的应用，有效降低抗生素及化学药物使用量，减少环境污染，保障养殖产品质量安全，具有良好的生态效益。解决了制约半滑舌鳎养殖业健康发展的病害防治关键技术难题，实现了绿色环保高效健康养殖目标。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。我们针对半滑舌鳎养殖的特点和现状，设计半滑舌鳎免疫促生长作用微生物筛选方案，从健康的半滑舌鳎肠道分离获得大量菌株，经过溶血性、消化酶活性及抑菌活性测试分析，并开展生产应用实验，观察了半滑舌鳎生长发育情况，测定了半滑舌鳎免疫指标、生长指标及存活率，筛选获得没有溶血性、具有消化酶活性、抑菌活性，同时具有提高半滑舌鳎免疫机能、促生长作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B7菌株。实施例1解淀粉芽孢杆菌B7的获得：(1)分离及纯化：取体重15g左右的健康半滑舌鳎于无菌条件下解剖取肠道，去除肠道内容物，用无菌生理盐水冲洗3次，称重后放到预冷的无菌玻璃匀浆器中匀浆，匀浆液100℃水浴10min，杀死非芽孢菌体，再梯度稀释至10-2，分别取匀浆原液、10-1、10-2三个梯度的稀释液100μL涂布在营养琼脂平板上，30℃恒温培养箱中培养48h。观察各个平板的菌落数量、形态、颜色及大小，挑取单菌落纯化培养，将纯化获得的菌株用简单复红染色镜检，剔除非芽孢杆菌，用石碳酸复红染色法进行革兰氏染色和芽孢染色，获得芽孢杆菌14株并保种备用。(2)菌株的筛选：以获得对半滑舌鳎具有免疫促生长作用的芽孢杆菌为目标，将分离纯化的芽孢杆菌进行溶血性、消化酶活性和抑菌活性筛选。首先将分离得到的芽孢杆菌在无菌营养肉汤中培养过夜，点种于血琼脂平板上，30℃恒温培养箱中培养24h，根据菌落周围是否形成透明圈，来判断溶血素的产生与否，筛选出不产生溶血素的芽孢杆菌9株；分别用淀粉培养基和脱脂乳培养基鉴别上述9株芽孢杆菌的产淀粉酶和蛋白酶能力，筛选出既产淀粉酶又产蛋白酶的菌株7株，采用牛津杯法对筛选出的7株芽孢杆菌进行抑菌活性测定，筛选出具有抑菌活性的菌株4株。综上，筛选获得不产溶血素、产淀粉酶、产蛋白酶且具有较强抑菌活性的芽孢杆菌一株，命名为B7。(3)菌株的鉴定：采用16SrDNA和gyrB基因序列分析方法，对分离筛选的芽孢杆菌B7进行属种鉴定。16SrDNA基因序列与NCBI数据库中解淀粉芽孢杆菌序列同源性达99％以上，gyrB基因序列与NCBI数据库中解淀粉芽孢杆菌序列同源性达99％以上；委托中国工业微生物菌种保藏管理中心进行生化鉴定，其生化特征与解淀粉芽孢杆菌较为一致。综合分子生物学及生化鉴定结果，芽孢菌株B7鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。(4)菌株的保存：将解淀粉芽孢杆菌B7，分类命名解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B7于2016年3月17日送至位于武汉大学校内的“中国典型培养物保藏中心”进行保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2016128。地址：中国，武汉，武汉大学)所述的营养琼脂平板是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养琼脂(NA)加蒸馏水溶解，加热，煮沸，灭菌，冷却倒板制成的；所述的无菌营养肉汤是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养肉汤(NB)加蒸馏水溶解煮沸灭菌制成的；所述的血琼脂平板是北京陆桥技术股份有限公司生产的；所述的淀粉培养基是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养琼脂(NA)加蒸馏水，每1000mL的培养基加2g可溶性淀粉，加热，煮沸，灭菌，冷却制成的平板；所述的脱脂乳培养基是北京陆桥技术股份有限公司生产的营养琼脂(NA)加蒸馏水，每1000mL的培养基加12g脱脂奶粉，加热，煮沸，灭菌，冷却制成的平板。实施例2解淀粉芽孢杆菌B7的特点：(1)菌落特征：接种于营养琼脂平板上30℃培养24h，菌落白色，粗糙，平坦，边缘不整齐；革兰氏阳性，菌体呈杆状，单个、成对或链状排列。(2)溶血性：将分离纯化得到的解淀粉芽孢杆菌B7接种在无菌营养肉汤中，30℃150rpm振荡培养24h，取10μl点种于血琼脂平板上，30℃恒温培养箱中培养24h，观察发现菌落周围没有形成透明圈，说明解淀粉芽孢杆菌B7不产生溶血素。(3)淀粉酶活性：将解淀粉芽孢杆菌B7接种到无菌营养肉汤中，于30℃150rpm振荡培养24h，4500rpm离心20min，取100μL上清液加入到放置在淀粉培养基上的牛津杯中，30℃恒温培养箱中培养24h。滴加少量碘液于培养基表面，轻轻旋转，使碘液铺满整个平板，发现牛津杯周围有透明圈，说明解淀粉芽孢杆菌B7分泌的淀粉酶将牛津杯周围的淀粉水解了。牛津杯的直径为8mm，水解形成的透明圈直径越大，说明产淀粉酶能力越强(详见表1)。(本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016128。

【技术特征摘要】
1.具有免疫促生长作用的解淀粉芽孢杆菌B7，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B7，保藏于中国典...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙金生，王雪惠，耿绪云，董学旺，薛淑霞，魏俊利，李晶晶，孙妍，
申请(专利权)人：天津市水生动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：天津,12