本发明专利技术公开了一种抗肿瘤多靶点复合抗原及其编码基因与应用。其目的是提供一种多靶点复合抗原及其编码基因与其在制备预防和／或治疗性肿瘤疫苗中的应用。该抗原具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：１的氨基酸残基序列。其编码基因具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：２的ＤＮＡ序列。本发明专利技术的多靶点复合抗原及其编码基因具有显著的抑瘤效果，且具有表达量高，易纯化，生产周期短，生产规模大，成本低的优点，可制备成预防和／或治疗性肿瘤药物及疫苗。本发明专利技术在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗原及其编码基因与应用，特别是涉及一种多靶点复合抗原及其编码基因与其在制备预防和/或治疗性肿瘤疫苗及药物中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁人类健康的最重要杀手之一。肿瘤的发生、发展和转移与肿瘤的血管形成密切相关，对根治性切除术的术后患者来说，无微血管侵袭的患者5年复发率为11％，而存在微血管侵袭的患者5年复发率高达50％。由于肿瘤区血管具有相同的特点，因此抗血管形成治疗适用于多种实体肿瘤。以血管为靶点、抑制血管形成，从而抑制肿瘤增殖和转移已成为一条新的肿瘤治疗途径。研究表明，血管的形成不仅仅取决于血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptors，VEGF-R)，同时也受到细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白受体—整合素(integrin)的影响.Nature，1997，390(6658)335-336.Ellis LM..Angiogenesis and its role incolorectal tumor and metastasis formation.Semin Oncol，2004，31(6)3-9.]。其中，VEGF-E、VEGF-R2和αVβ3与肿瘤血管形成的关系最为密切，可以作为抑制病理性血管形成的直接靶标。VEGF是一种内皮细胞特异性的丝裂源，在体内诱导血管生成，是作用最强的血管形成因子之一。现已发现VEGF家族包括VEGF-A、B、C、D、E和胎盘生长因子(placentagrowth factor，PIGF)，其中VEGF-E仅在病理性血管中高表达.CancerBiology，1999，9(3)211-220.]。有实验证实，应用抗VEGF的单克隆抗体可封闭已分泌的VEGF，阻断血管形成过程的信号转导，从而抑制肿瘤的生长和转移.Br J Cancer，2001，85(2)273-278.Lichtenbeld HC，Ferarra N，Jain RK，et al.Effectof local anti-VEGF antibody treatment on tumor microvessel permeability.Microvasc Res，1999，57(3)357-362.]。抗VEGF-E单克隆抗体现在正处于III期临床。VEGF-E是从羊口疮病毒感染组分离出来的，是一种分泌型二聚体糖蛋白，既可以分泌到细胞外，也可以结合到细胞表面或细胞外基质，具有最佳的生物利用度和生物潜能。每个单体含有8个特征性的半胱氨酸残基，这些半胱氨酸通过二硫键形成3个环状结构loop-1、-2和-3，构成其主要的功能区域。EGF受体家族目前已发现5种，其中VEGF-R1(Flt-1)、VEGF-R2(KDR/Flk-1)和VEGF-R3(Flt-4)属于酪氨酸蛋白激酶受体(receptortyrosine kinases，RTKs)超家族，另外两种为Npn(neuropillin)-1和-2，它们在内皮细胞分化和血管形成中发挥关键性作用。VEGF-R2在胚胎血管内皮细胞中高表达，而在成熟血管中表达下降，说明它在促进血管发生及再生中起作用。VEGF-R2的胞外区域包含七个免疫球蛋白样区域、一个酪氨酸激酶区域以及一个跨膜区域，其中第二和第三个免疫球蛋白样区域组成高亲和性的配体结合区。近年来，对血管形成机理的研究已经越来越完善。研究发现，肿瘤血管的形成不仅取决于内皮生长因子及其受体，也受到细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白受体—整合素αVβ3的影响.J Clin Invest，1996，98(2)426-433.]。肿瘤组织中新生的血管内皮细胞表达高水平的αVβ3，而成人正常血管内皮细胞中无表达或某些组织极低水平表达。它可以在内皮细胞表面引发MMP-2降解基质的活性，并且抑制内皮细胞的p53及其所诱导的p21蛋白的活性，从而表现出抗凋亡效应。大量实验表明，动物体内应用整合素αVβ3拮抗剂，可导致参与生成血管的内皮细胞的凋亡；抗αVβ3抗体或αVβ3的拮抗剂能破坏鹌鹑胚胎、鼠视网膜、兔角膜的新生血管生成；肿瘤模型中应用αVβ3的拮抗剂不仅阻止了肿瘤相关的血管生成，而且可以引起肿瘤的退缩。αVβ3是由αV链和β3链非共价结合构成的一个异二聚体的跨膜糖蛋白，是一个能与ECM广泛结合的受体，凡是具有RGD序列(Arg-Gly-Asp)的ECM蛋白均能与其结合。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对肿瘤具有抑制作用的多靶点复合抗原。本专利技术所提供的多靶点复合抗原，命名为ERV，具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列。序列表中的SEQ ID №1由404个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-96位为以口疮病毒VEGF-E为靶点的抗原序列，其中，自氨基端第23-30位为Loop1的氨基酸残基序列，自氨基端第46-51位为Loop2的氨基酸残基序列，自氨基端第68-73位为Loop3的氨基酸残基序列；自氨基端第97-238位为以非洲爪蟾αVβ3为靶点的抗原序列；自氨基端第239-404位为以VEGF-R2为靶点的抗原序列，其中，自氨基端第243-293位为来源于鹌鹑的VEGF-R2第二个免疫球蛋白样区域的氨基酸残基序列，自氨基端第339-400位为来源于小鼠的VEGF-R2第三个免疫球蛋白样区域的氨基酸残基序列，自氨基端第294-338位为来源于人的连接区的氨基酸序列。编码上述多靶点复合抗原ERV的基因也属于本专利技术的保护范围，可具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。序列表中的SEQ ID№2由1212个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1212位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。其中，自5’端第1-288位碱基编码以口疮病毒VEGF-E为靶点的抗原序列，自5’端第289-714位碱基编码以非洲爪蟾αV β3为靶点的抗原序列，自5’端第715-1212位碱基编码以VEGF-R2为靶点的抗原序列。含有本专利技术多靶点复合抗原ERV基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本专利技术的保护范围。扩增所述抗原基因中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。与上述多靶点复合抗原ERV特异结合的抗体也属于本专利技术的保护范围，所述抗体包括单克隆抗体及多克隆抗体，均可按照常规方法制备。本专利技术的另一个目的是提供一种表达上述多靶点复合抗原ERV的方法。本专利技术所提供的表达上述多靶点复合抗原ERV的方法，是将含有上述多靶点复合抗原ERV基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到多靶点复合抗原ERV。用于构建所述重组表达载体的出发载体可为在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体，如pGEX-4T-2、pET-3a、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c，优选为pGEX-4T-2。以pGEX-4T-2为出发载体，构建的含有所述血管内皮生长因子VEGF-E抗原基因的重组表达载体为pGEX-ERV。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺本文档来自技高网...
【技术保护点】
多靶点复合抗原，具有序列表中ＳＥＱＩＤ№：１的氨基酸残基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于继云，刘颖，阎瑾琦，陈兴，宋晓国，贾锐，刘国栋，王浩，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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