一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物制造技术

一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物，它由核酸适体、鱼精蛋白和小分子干扰核糖核酸三部分构成，复合物的复合方法步骤是，将核酸适体和小分子干扰核糖核酸按照摩尔比１∶１的比例用生理盐水或者磷酸盐缓冲液溶解，超声混匀。将鱼精蛋白溶解于生理盐水或者磷酸盐缓冲液，超声混匀促溶，然后将混合液缓慢加入鱼精蛋白中，鱼精蛋白和核酸适体以及小分子干扰核糖核酸的最佳摩尔比为１∶１∶１，低速震荡混匀５ｍｉｎ，室温静置２０－３０ｍｉｎ，置于－２０℃长期保存。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，具体的说是一种用于肿瘤等疾病生物靶向治疗的 新型复合物。
技术介绍
在本专利技术提出之前，应用于肿瘤生物治疗方面的药物已经有很多，如免疫刺激剂、 抗体药物、基因干扰药物等等，但是都存在着各种各样的问题使得其效果并不明显，免疫刺 激剂的使用容易引起免疫过度导致自身免疫疾病，抗体药物因为其外界蛋白的属性而引起 的免疫反应很常见，基因干扰技术其疗效是值得肯定的，但是使用的载体却存在很大问题， 严重的阻碍着基因干扰技术在临床疾病特别是肿瘤疾病中的使用。目前存在的主要的应 用于临床疾病干预的基因干扰制剂包括裸小分子核糖核酸(siRNA)、胆固醇结合的siRNA、 脂质体或者阳离子复合物结合的siRNA复合物以及抗体siRNA复合物等等，但是这些应用 均有局限性，裸siRNA的使用只能在眼睛、呼吸道以及脊髓中属于局部使用，胆固醇结合的 siRNA制剂的使用则是主要针对高血脂的治疗，脂质体或者阳离子复合物和siRNA的复合 物没有特定细胞的靶向性，抗体和siRNA结合的使用受抗体免疫原性的限制，所以探讨一 种新的靶向性强、安全的可以广泛使用的用于肿瘤等疾病治疗的RNAi载体势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物，以解决上述肿 瘤治疗特别是肿瘤的生物靶向治疗中的难题。本专利技术设计人通过大量研究，提出和构建了 一种基于核糖核酸干扰技术(RNAi)的新型肿瘤靶向治疗载体即核酸适体-鱼精蛋白-小 分子干扰核糖核酸复合物(aptamer-protamine-siRNA)，这种复合物的构成由三部分构成， 本专利技术复合物的合成方式将aptamer和siRNA按照摩尔比1 1的比例用生理盐水或者 磷酸盐缓冲液溶解，超声混勻，计算鱼精蛋白的摩尔数，其和aptamer以及siRNA的最佳摩 尔比为1 1 1(可以使用的范围为 )，溶解于生理盐 水或者磷酸盐缓冲液，超声混勻促溶，然后将核酸混合液缓慢加入鱼精蛋白中，低速震荡混 勻5min，室温静置20-30min，置于-20°C长期保存。其中鱼精蛋白起到桥梁作用，它具有结 合核酸的功能，可以将另外两种核酸成分结合起来形成复合物，核酸适体具有识别靶向细 胞表面特异性抗原的作用，而所携带的siRNA则可以起到沉默靶向基因的作用，所以该新 型复合物可以靶向识别特定细胞(如肿瘤细胞)并且靶向沉默关键基因(如癌基因等)从 而起到疾病(如肿瘤)治疗的作用。应用本专利技术，该复合物可以用于肿瘤等疾病的生物靶向治疗，也可以应用于科学 研究中siRNA进行基因干扰的研究。本专利技术与现有的肿瘤生物靶向药物相比较，充分显示其创新点和优点为①特异 性和多重靶向性^ptamer高效靶向识别肿瘤细胞表面特异性抗原、siRNA特异沉默靶基 因，其靶向性非常明确，不影响其他正常细胞的功能，只针对目的肿瘤细胞；不干预其他基因，只针对靶向基因；②安全性该复合物为小分子纳米级制剂，鱼精蛋白是临床医学得以 批准应用的小分子多肽，安全性得以保障；aptamer、siRNA是经过化学修饰的较稳定的小 分子RNA制剂，降解和清除时间为3-4天，无毒副作用；③aptamer和siRNA都可以进行靶向 性替换，针对不同肿瘤选用不同的表面抗原的aptamer (如针对乳腺癌中的erbB3、erbB2, 前列腺癌的PMSA、宫颈癌的ScFv，直肠癌的CEA等肿瘤细胞特异性的细胞表面抗原的 aptamer均适应本复合物)以及不同肿瘤关键基因的siRNA(如针对Ras、Jak、Pi;3k、c-myc、 XIAP, survivin、livin、CDKs等在肿瘤生成以及肿瘤转移中其重要作用的基因的siRNA均 适应于本复合物)。附图说明附图1 本专利技术复合物合成结构示意附图2 通过荧光显微镜观察vehicle组为生理盐水对照组，未看到有荧光表达； APFAMsiRNA组为加入了携带荧光siRNA的复合物组，可以看到有荧光表达，说明可以复合 物进入到肿瘤细胞中；附图3 通过流式细胞仪检测荧光表达在APFAMsiRNA组表达明显高于vehicle 生理盐水对照组；附图4 通过荧光显微镜观察加入携带EGFP siRNA的复合物组，EGFP荧光表达的 细胞较未加入的EGFP组明显减少，说明复合物可以起到干扰EGFP表达的作用；附图5 流式细胞仪检测加入携带EGFP siRNA的复合物组细胞绿色荧光表达明显 较单纯转染EGFP质粒组降低；附图6 蛋白质免疫印迹法检测发现加入携带EGFP siRNA的复合物组细胞GFP蛋 白的表达水平明显降低；附图7 逆转录-聚合酶链反应法检测加入携带survivin siRNA的复合物组细胞 survivin在mRNA水平的表达明显降低，说明aptamer-protamine-sisurvivin复合物可以 明显的降低细胞中survivin这一癌基因的表达；附图8 蛋白质免疫印迹法检测发现加入aptamer-protamine-sisurvivin复合物 组细胞survivin在蛋白质水平的表达明显降低；附图9 =MTT法检测发现加入aptamer-protamine-sisurvivin复合物组细胞的生 长明显变缓，说明在关键癌基因survivin受到抑制之后，细胞的生长受到明显影响；附图10 细胞凋亡检测(Armexin-V/PI法)发现加入 aptamer-protamine-sisurvivin复合物组细胞凋亡发生率明显升高，说明在survivin表 达受到沉默之后，部分细胞走向凋亡；附图11 逆转录-聚合酶链反应法检测加入携带⑶KlsiRNA的复合物组细胞⑶Kl 在mRNA水平的表达明显降低，说明aptamer-protamine-si⑶Kl复合物可以明显的降低细 胞中CDKl这一关键细胞周期调控基因的表达；附图12 蛋白质免疫印迹法检测发现加入aptamer-protamine-siCDKl复合物组 细胞CDKl在蛋白质水平的表达明显降低；附图13 :MTT法检测发现加入aptamer-protamine-siCDKl复合物组细胞的生长变 缓，说明在关键细胞周期调控基因CDKl受到抑制之后，细胞的生长受到比较明显影响，增殖变慢；附图14 流式细胞仪检测发现加入aptamer-protamine-siCDKl复合物组处于 G2-M期的细胞比例明显增加，说明在关键的细胞周期调控基因CDKl受到干扰之后，细胞周 期运行受到明显改变；附图15 在体尾静脉注射aptamer-protamine-sisurvivin组裸鼠成瘤能力下降， 肿瘤大小和重量均较生理盐水对照组小得多，说明复合物在体内也可以发挥干扰癌基因的 表达的作用，起到抑制肿瘤生长的效果；附图16 逆转录-聚合酶链反应法检测发现aptamer-protamine-sisurvivin组 裸鼠肿瘤组织survivin在mRNA水平的表达明显较生理盐水对照组低；附图17 蛋白质免疫印迹法检测发现aptamer-protamine-sisurvivin组裸鼠肿 瘤组织survivin在蛋白质水平的表达明显较生理盐水对照组低。具体实施方式本专利技术的合成方法实例本专利技术提出和构建了一种基于核糖核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物，它由核酸适体、鱼精蛋白和小分子干扰核糖核酸三部分构成，其特征在于：复合物的复合方法步骤是，１）将核酸适体和小分子干扰核糖核酸按照摩尔比１∶１的比例用生理盐水或者磷酸盐缓冲液溶解，超声混匀；２）将鱼精蛋白溶解于生理盐水或者磷酸盐缓冲液，超声混匀促溶，然后将１）中的混合液缓慢加入鱼精蛋白中，鱼精蛋白和核酸适体以及小分子干扰核糖核酸的最佳摩尔比为１∶１∶１，低速震荡混匀５ｍｉｎ，室温静置２０－３０ｍｉｎ，置于－２０℃长期保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚建平，徐向上，张鹏，陶德定，曹志新，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]