一种人胰高血糖素样肽－１衍生物及其固相化学合成制造技术

一种具有人胰高血糖素样肽－１活性的人胰高血糖素样肽－１衍生物及其制备和应用，属于生物工程技术领域。该衍生物的分子结构式为以下的三种结构式：ＧＬＰ－１（７－３７）－Ｘａａ３８（Ｓｅｑ　　ＩＤ　　Ｎｏ．２），ＧＬＰ－１（７－３７）－Ｘａａ３８－Ｘａａ３９（Ｓｅｑ　　ＩＤ　　Ｎｏ．３）和ＧＬＰ－１（７－３７）－Ｘａａ３８－Ｘａａ３９－Ｘａａ４０（Ｓｅｑ　　ＩＤ　　Ｎｏ．４）之一，其中Ｘａａ３８，Ｘａａ３９和Ｘａａ４０分别是Ｃｙｓ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ和Ｔｈｒ中的任何一个氨基酸。采用固相化学合成制备该衍生物。该衍生物具有长于ＧＬＰ－１的半衰期；通过固相化学合成制备，生产步骤少，生产成本低，特别适于在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)活性的人胰高血糖素样肽-1衍生物(GLP-1衍生物)及其固相化学合成，属于生物工程

技术介绍
1929年，Zunz和Labbare将一类从肠道中分离出来的、可以促进葡萄糖刺激胰岛素分泌的体液因子命名为肠降糖素(incretin)，GLP-1是其中的主要成分。GLP-1在体内有两种形式，一种为GLP-1(7-36)-NH2，由30个氨基酸残基组成，另一种为GLP-1(7-37)，由31个氨基酸残基组成，二者有相同的生物学活性。GLP-1是进食后由远端回肠、结肠和直肠的L细胞分泌释放的氨基酸的多肽激素，对糖代谢和胃肠道运动及分泌有很强的作用。GLP-1通过与胰岛β细胞表面的特异受体相互作用，使葡萄糖诱导的胰岛素分泌作用显著增强，同时还具有维持并增加胰岛β细胞数目、抑制肠胃排空及抑制胰高血糖素的分泌等作用。GLP-1的促胰岛素分泌作用依赖于葡萄糖的浓度，当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1显著促进胰岛素分泌，而一旦血糖恢复至正常值则不再继续作用，因此，用其治疗糖尿病不会发生低血糖，对于II型糖尿病的预防和治疗具有良好的应用前景。但是，GLP-1在体内很容易被二肽酰基肽酶IV(DipeptidylPeptidase 4，DPP IV)降解为脱去His7-Ala8-残基的无活性的GLP-1(9-37)或GLP-1(9-36)-NH2。静脉注射GLP-1在体内的半衰期仅为3～5分钟。因此GLP-1在临床应用上还是存在很大的缺陷，迫切需要开发半衰期较长的具有更好临床使用价值的GLP-1衍生物。目前GLP-1治疗糖尿病的研究方向之一是通过对GLP-1的结构进行改变，得到GLP-1衍生物，用该衍生物治疗糖尿病，达到延长药物在体内的药效时间的目的。已有的GLP-1衍生物都显示出稳定性增加，且体内生物活性仍能维持的性质。如在C端进行脂肪酸修饰制备的GLP-1衍生物具有与血浆白蛋白结合能力增强的特性，能延长其生物活性，与天然GLP-1相比，半衰期已显著延长，但是，仍然存在制备和纯化困难等缺陷。
技术介绍
采用DNA重组技术制备GLP-1衍生物，见本申请人申请的申请号和专利技术名称分别为“200610024355.X”和“一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用”的专利技术专利。
技术介绍
虽能制备GLP-1衍生物，但有以下缺点利用大肠杆菌作为GLP-1衍生物表达的宿主菌，在后续纯化过程中，需要检测和控制大肠杆菌内毒素以及大肠杆菌DNA的残留量，增加了生产步骤和生产成本。
技术实现思路
GLP-1在体内有两种形式，一种为GLP-1(7-36)-NH2，由30个氨基酸残基组成，另一种为GLP-1(7-37)，由31个氨基酸残基组成，二者有相同的生物学活性。本专利技术涉及的GLP-1指GLP-1(7-37)，其序列(Seq ID No.1)罗列如下His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。本专利技术提出的GLP-1衍生物具有以下三种结构GLP-1(7-37)-Xaa38(Seq ID No.2)，GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39(Seq ID No.3)和GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40(Seq ID No.4)之一，其中Xaa38，Xaa39和Xaa40分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。该衍生物不仅保持了天然GLP-1在体内的活性，还明显延长了体内药效时间，体内药效时间至少可持续3小时，具有良好的临床使用价值。所述的衍生物的进一步特征在于，该衍生物具有以下三种结构GLP-1(7-37)-Xaa38(Seq ID No.2)，GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39(Seq ID No.3)和GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40(Seq ID No.4)之一，其中Xaa38＝Cys，Xaa39和Xaa40分别＝Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。所述的衍生物的进一步特征在于，该衍生物具有以下两种结构GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39(Seq ID No.3)和GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40(Seq ID No.4)之一，其中Xaa39＝Cys，Xaa38和Xaa40分别＝Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。所述的衍生物的进一步特征在于，该衍生物具有以下结构GLP-1(7-37)-Xaa38-Xaa39-Xaa40(Seq ID No.4)，其中Xaa40＝Cys，Xaa38和Xaa39分别＝Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。本专利技术的目的是提供固相化学合成上述衍生物的方法。固相化学合成法在制备少于40个氨基酸的小肽工艺十分成熟，具有快速、纯化简便等优点，且在后续处理过程中不存在检测内毒素等问题，生产步骤少，生产成本低。为实现上述目的，本专利技术的技术方案选用固相化学合成法来制备GLP-1衍生物。现详细说明本专利技术的技术方案。一种GLP-1衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，具体操作步骤(1)用的带保护基的氨基酸单体共有17个，它们是Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，其中缩写表示Fmoc9-芴基甲氧羰基Boc叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)Trt三苯甲基(trityl)OtBu叔丁基酯 tBU叔丁基(tert-butyl)Pbf2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-苯磺酰基；(2)需用的仪器设备及试剂仪器SYMPHONY型12通道多肽合成仪，型号SYMPHONY，美国产品；试剂N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶(Dimethylaminopyridine)/DMF N，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine)/NMP，HBTU 100mmol/0.5M HOBT in DMFN，N-二环己基碳二亚胺(N，N-Dicyclohexylcarbodiimide)/NMP，其中DMF为N，N-二甲基甲酰胺NMP为N-甲基吡咯烷酮HOBT为1-羟基苯并三唑HBTU为2-(1氢苯并三唑基)——四甲基脲六氟磷酸盐(2-(1H-benzo本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＧＬＰ－１衍生物的固相化学合成方法，其特征在于，具体操作步骤：（１）需用的带保护基的氨基酸单体共有１７个，它们是：Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｔｒｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ，其中缩写表示：Ｆｍｏｃ：９－芴基甲氧羰基Ｂｏｃ：叔丁氧羰基（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）Ｔｒｔ：三苯甲基（ｔｒｉｔｙｌ）ＯｔＢｕ：叔丁基酯ｔＢＵ：叔丁基（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ）Ｐｂｆ：２，２，５，７，８－五甲基苯并二氢吡喃－６－苯磺酰基；（２）需用的仪器设备及试剂仪器：ＳＹＭＰＨＯＮＹ型１２通道多肽合成仪，型号：ＳＹＭＰＨＯＮＹ，美国产品试剂：Ｎ－甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦＮ，Ｎ－二异丙基乙胺（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）／ＮＭＰ，ＨＢＴＵ１００ｍｍｏｌ／０．５ＭＨＯＢＴｉｎＤＭＦＮ，Ｎ－二环己基碳二亚胺（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）／ＮＭＰ，其中：ＤＭＦ为Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺ＮＭＰ为Ｎ－甲基吡咯烷酮ＨＯＢＴ为１－羟基苯并三唑ＨＢＴＵ为２－（１氢苯并三唑基）－－四甲基脲六氟磷酸盐（２－（１Ｈ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ－ｙ１－１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｕｒｏｎｉｕｍｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；（３）操作：第一步多肽树脂的合成以０．２５ｍｍｏｌ规模为例，称取王氏树脂０．２５ｇ，置入ＳＹＭＰＨＯＮＹ型１２通道多肽合成仪上的反应器中，将带保护基的氨基酸单体称取１ｍｍｏｌ装瓶，按ＧＬＰ－１衍生物的氨基酸序列（ＳｅｑＩＤＮｏ．２）从Ｃ－端向Ｎ－端排列在所述的合成仪中，２５℃下，由计算机程序控制自动进行脱Ｆｍｏｃ保护、活化、连接，然后再进行下一轮循环，如此完成合成，得...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐进，黄静，吴自荣，金丽，叶海峰，易正芳，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]