纯化抗体的工艺制造技术

本发明专利技术涉及在液体中从一种或多种混杂物纯化抗体的工艺，该工艺包括使所述液体与包含支持物的第一层析树脂接触，所述支持物上已经固定了多式配体，来将所述抗体吸附到所述树脂上，其中每个多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统；添加洗脱液以从所述树脂释放抗体；用第二层析树脂接触如此获得的洗出液。在一个实施方式中，所述芳香族或杂芳香环实体的成环原子选自由Ｃ、Ｓ或Ｏ构成的组，和所述阳离子交换基团是弱阳离子交换剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及纯化抗体，例如单克隆抗体的工艺。更具体地，本专利技术涉及俘获抗体的方法；使用至少两个层析步骤纯化抗体的工艺；使用本专利技术的方法纯化抗体的试剂盒；和层析柱。背景免疫系统由许多相互依赖的细胞类型组成，它们集体地保护躯体对抗细菌、寄生虫、真菌、病毒感染和对抗肿瘤细胞的生长。免疫系统的卫士是它们宿主的血流中不断地漫游的巨噬细胞。当受到感染或免疫的攻击时，巨噬细胞通过吞入标记了称为抗原的外来分子的侵入物来进行响应。这个由辅助T细胞介导的事件建立了引起B细胞刺激的复杂的反应链。这些B细胞随后产生称为抗体的蛋白，其与外来侵入物结合。在抗体和抗原之间的结合事件标记了外来侵入物以通过吞噬作用或补体系统的活化来进行破坏。存在着许多不同种类的抗体或免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们的不同不仅在于生理学作用，还在于它们的结构。从结构的角度来看，IgG抗体是已经广泛研究了的特别种类的免疫球蛋白，可能是由于它们在成熟免疫反应中起到的显著作用。当今在人类和兽医学的诊断、保健和治疗领域的大量不同应用中利用了免疫球蛋白拥有的生物学活性。实际上，在近几年中，单克隆抗体和重组抗体构建体已经成为当前在临床试验中进行研究的和接受FDA批准作为治疗剂和诊断剂的最大一类蛋白。作为对表达系统和产生策略的补充，设计了纯化方案来以简单和低成本的方式获得高纯度抗体。分离免疫球蛋白的传统方法基于包含免疫球蛋白的蛋白级分的选择性可逆沉淀，而将其他的蛋白质组群留在溶液中。典型的沉淀试剂是乙醇、聚乙二醇、易溶盐例如硫酸铵和磷酸钾和辛酸。一般地，这些沉淀方法得出非常不纯的产物而同时是费时和费力的。此外，向原料中添加沉淀试剂使得难以将上清液用于其他目的并且产生了处理难题，当论及免疫球蛋白的大规模纯化时这是特别相关的。分离免疫球蛋白的可选择的方法是层析，其包括紧密相关的分离方法的家族。将层析与大多数其他物理和化学的分离方法区分开来的特征是使两种互不混合的相接触，其中一个相是固定的，另一个是移动的。引入移动相的样品混合物在被移动相携带通过系统时，在固定相和移动相之前经历了一系列的相互作用。相互作用利用了样品中的成分的物理或化学性质的差异。在移动相运动通过含有固定相的柱的影响下，这些差异决定了单个组分的移动速度。分离的成分按照与固定相的相互作用升高的顺序出现。阻滞最小的成分首先洗脱，最强烈滞留的材料最后洗脱。当样品成分从柱上洗脱时，当一种成分被阻滞到足以防止与邻近的溶解物的区域重叠时，得到了分离。对于每种特定的分离目的不断地进行着努力来设计最佳的固定相。这种固定相通常包含支持基质或基础基质，在其上连接了包含功能基团即结合基团的配体。根据所利用的相互作用的原理，对每一种层析都给出了参考。工业上的层析工艺常常包括超过一个的步骤，从俘获步骤开始、其是从粗的或澄清的进料初步纯化目标分子；随后是中间纯化步骤和最终的精炼步骤。离子交换层析常被用于免疫球蛋白的分离。在阴离子交换层析中，免疫球蛋白的带负电的氨基酸侧链将与层析基质的带正电的配体相互作用。另一方面在阳离子交换层析中，免疫球蛋白的带正电的氨基酸侧链将与层析基质的带负电的配体相互作用。疏水性相互作用层析(HIC)也是用于免疫球蛋白分离的广泛描述的方法。然而，疏水性基质需要向原料中添加易溶盐来使免疫球蛋白有效地结合。通过以连续的或阶梯式的梯度来降低易溶盐浓度，从基质上释放结合的抗体。如果目的是高纯度产品，建议的是将疏水性层析与进一步的步骤结合。这种步骤的缺点是必需向原料中添加易溶盐，因为这产生了一些难题并且因而提高了大规模使用的成本。对于除了细胞培养上清液以外的其他原料，例如，乳清、血浆和蛋黄，向原料添加易溶盐在许多情况下阻碍了大规模应用，因为盐会妨碍耗尽了免疫球蛋白的原料的任何经济上可行的用途。在大规模应用中的另外的难题是数千升废料的处理。蛋白A和蛋白G亲和层析是用于分离和纯化免疫球蛋白、特别是分离单克隆抗体的流行和普遍的方法，主要是由于易于使用和所获得的高纯度。与离子交换、疏水性相互作用、羟磷灰石和/或凝胶过滤步骤，特别是基于蛋白A的方法组合使用，已经成为许多生物药公司选择的抗体俘获方法，参见，例如WO8400773和US 5,151,350。已经建议了将蛋白A层析与疏水性相互作用层析(HIC)组合。US 5,429,746(SmithKline Beecham Corp.)涉及应用疏水性相互作用层析作为抗体纯化中的一个步骤。其中公开了可以在采用例如蛋白A的亲和层析之后如何使用HIC，任选的具有中间的阳离子交换层析步骤。通过弱阳离子交换剂(CM SepharoseTMFF)说明了阳离子交换层析，其被调节到pH 5.5用于吸附，用40mM柠檬酸盐、100mM氯化钠pH 6的洗脱缓冲液来洗脱。将混合物施加到HIC柱，随后是亲合性和/或阳离子交换层析，则可能含有混杂物，例如免疫球蛋白聚集物、错误折叠的碎片、宿主细胞蛋白和来自亲和层析步骤的残余材料。在这种工艺中，抗体首先吸附到蛋白A层析支持物上并被洗脱，然后吸附到阳离子交换层析支持物并从上选择性地洗脱；最后吸附到HIC支持物并被洗脱。作为对基于蛋白的亲和柱的替代，已经提出了将纯化学的树脂，例如多式树脂用于抗体纯化，其中不同的但共同作用的位点与目标相互作用。一个商业上可获得的实例是MBI Hypercel(BioSepra)，是一种包含巯基-苯并咪唑-磺酸配体的吸附剂，声称提供了疏水性以及与抗体的离子相互作用。疏水性相互作用假定是归因于芳香环系统，而离子相互作用应当归因于SO3-取代基，已知其是强阳离子交换剂。此外，MBI配体的芳香族系统的氮原子是在一定条件下可带电的，因而可以提供与带负电基团的离子相互作用。US 6,498,236(Upfront Chromatography)公开了一种从溶液，例如杂交瘤细胞培养上清液、动物血浆或血清分离或纯化免疫球蛋白的方法。提出了将该方法作为对使用蛋白A、蛋白G、合成肽和其他相对高分子量配体的替代，由于配体和免疫球蛋白的各自分子量之间的微小差异，以及由于它们相互结合的天然趋势，已经陈述了这些配体包含了一些缺点。根据US 6,498,236，在它们的配体上存在的取代基的性质对于有效地结合免疫球蛋白是决定性的。更具体地，在所公开的方法中使用的固相基质由化学式M-SP1-X-A-SP2-ACID来描述，其中M代表基质主干，SP1代表间隔区，X代表O、S或NH，A代表单环或二环的任选的取代芳香族或芳香杂环部分，SP2代表任选的间隔区和ACID代表酸性基团。配体优选的来源于选自由苯并咪唑、苯并噻唑和苯并唑构成的组的化合物。WO97/10887(Novo Nordisk A/S)涉及亲和性配体-基质的结合物，在蛋白质材料例如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素或类似物、衍生物和其片段的纯化中是有用的。专利技术WO97/10887是基于这种观点，疏水性配体的选择性可以通过提高疏水性成分的复杂度和空间几何结构来提高。这个观点引起了一组亲和性配体的发现，这个组限于具有杂芳香族实体的结构，其中至少一个成环原子是氮。进一步的，在WO 03/024588(Amersham Biosciences，Uppsala本文档来自技高网...

【技术保护点】
从液体中俘获一种或多种抗体的方法，所述方法包括使所述液体接触包含支持物的层析树脂，所述支持物上已经固定了多式配体，来将抗体吸附到所述树脂上，其中每个多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统，在所述系统中成环原子选自由碳（Ｃ）、硫（Ｓ）和氧（Ｏ）原子构成的组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A格伦贝里，BL约翰松，HJ约翰松，JL马卢瓦塞尔，N泰弗南，
申请(专利权)人：通用电气健康护理生物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]