MUC5AC抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及特异性识别ＭＵＣ５ＡＣ的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１５０９、ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１５１１的杂交瘤细胞产生。本发明专利技术还涉及包含上述单克隆抗体的用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，以及ＭＵＣ５ＡＣ抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质工程、基因工程和生物医药领域，具体涉及MUC5AC抗体及其在诊断肿瘤中的用途。
技术介绍
Mucins是组成黏液的主要成分，它们是由上皮中分泌型细胞分泌的的一种高分子量的O型糖蛋白。其主要作用是作为有机体细胞的防御机制来抵御外界环境对细胞表皮的侵害以及润滑细胞表皮。此外，它们还在生长、胎儿发育以及上皮的更新、分化、完整性、癌变过程和转移中起到一定的作用。分析其氨基酸表明，它是由含高比例的丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸和氨基乙酸的VNTR(variable numberof tandem repeats)和O型糖链组成。MUC5AC是一类高分子量的糖蛋白，属于mucin家族中凝胶体型(gel-forming)。其分布于11号染色体p15.5区域上的一段400kb，富含CpG岛的区域。其去糖基化后的蛋白骨架中富含半胱氨酸。MUC5AC在foveolar细胞中以及窦部高表达。在正常组织和癌变的组织中，MUC5AC的表达量和糖基化形式都发生变化，因此，MUC5AC在多种肿瘤检测中都有所应用，但是都以免疫组化为试验基础，没有应用于临床。在这些试验中证实，不同类型的胃癌中MUC5AC的表达形式不同，而且早期胃癌以及混合型胃癌较其他种类的胃癌MUC5AC高表达。因此，还需要进一步研究确定该蛋白是否可以作为血清检测的肿瘤标志物，能否应用于肿瘤的诊断和治疗，特别是消化道上皮肿瘤如胃癌的诊断和治疗。
技术实现思路
为实现上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一对能特异性识别MUC5AC的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.1509、CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生。本专利技术另一方面提供了一种用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含一对抗体，由保藏号为CGMCC NO.1509的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第一抗体，以及由保藏号为CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第二抗体。本专利技术另一方面还涉及MUC5AC抗体、尤其是上述单克隆抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。本专利技术的MUC5AC抗体，尤其是本专利技术获得的单克隆抗体能够用于血清学检测各种肿瘤。本专利技术的其它目的和优点可从以下的详细描述中得知。附图说明图1显示实施例1中密度梯度离心的结果。图2显示了用MUC5AC单克隆抗体进行Western检测的结果。图3显示了抗体配对的标准曲线，其中横坐标表示抗原浓度，纵坐标表示酶标值。具体实施例方式本专利技术第一方面提供了两个能特异性识别MUC5AC的单克隆抗体，所述单克隆抗体分别由保藏号为CGMCC NO.1509、CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生。本文所用的术语“抗体”指由至少一个抗体结合位点组成的一个或一组多肽，其具体包括单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性(即与MUC5AC特异性结合)。术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段，每个片段有单个抗原结合部位)，以及一个残余的“Fc”片段(如此称呼是因为它很容易结晶)。用胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段(它具有两个能与抗原交联的抗原结合片段)以及一个残余的其它片段(称为pFc′)。其它片段可包括二抗体、线性抗体、单链抗体分子和抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用的，关于抗体的术语“功能性片段”是指Fv，F(ab)和F(ab′)2片段。本文所用的术语“单克隆抗体”指从一群基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规(多克隆)抗体制剂(通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。本文的单克隆抗体还包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)(其中重链和/或轻链的一部分与特定动物种类衍生的、或是属于特定的抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而链的其余部分则与另一动物衍生的、或是属于另一抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源)以及这些抗体的片段，只要这些片段具有所需的生物活性即可。针对MUC5AC的单克隆抗体可用常规方法制得。通常，首先用MUC5AC蛋白来免疫合适的动物，较佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。所述MUC5AC蛋白可从商业途径获得，或是根据常规分子克隆和基因重组表达技术来获得，另外也可用胶层析与密度梯度离心等方法从诸如HT-29等细胞株分离获得。由于可获得的血清体积多，能获得标记的抗家兔和抗山羊抗体，因此对于制备多克隆抗血清来说，家兔和山羊是较佳的。免疫通常这样进行将蛋白以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。随后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐剂)配的蛋白质注射一次或多次以强化免疫。另外可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体。用Kohler和Milstein的标准方法或其改进方法可制得单克隆抗体。通常，如上所述对啮齿类动物如小鼠和大鼠进行免疫。当然，也可用家兔、羊或蛙细胞。采用大鼠可能会有某些优点，但是小鼠是较佳的，其中BALB/c小鼠是最佳的，它是最常用的动物，通常能提供较高比例的稳定融合。为了产生单克隆抗体，在免疫接种后，选择具有生产抗体潜力的体细胞，具体是B淋巴细胞(B细胞)，以用于单克隆抗体生产程序。这些细胞可从活检的脾脏、扁桃体或淋巴结、或周围血液样品获得。脾细胞和周围血细胞是较佳的，因为前者是处于分裂的浆母细胞阶段的抗体产生细胞的丰富来源，而后者周围血液很容易获得。通常是对一组动物免疫接种，取出抗体滴度最高的动物的脾脏。用注射器将脾脏匀浆，获得脾淋巴细胞。免疫接种过的小鼠的脾脏通常含有约5×107至2×108的淋巴细胞。然后，使免疫接种的动物的产生抗体的B细胞与无限增殖骨髓瘤细胞系(通常与免疫接种动物的种类相同)融合。适用于产生杂交瘤融合程序的骨髓瘤细胞系最好不产生抗体，融合效率较高，且有酶缺陷，使得它们不能在某些只支持所需融合细胞(称为杂交瘤)生长的选择性培养基中生长。可采用许多骨髓瘤细胞中的任何一种，它们是本领域技术人员中已知的。例如，当免疫接种的动物是小鼠时，可采用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp2/0、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，可采用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均可与人细胞融合结合。一种较佳的小鼠骨髓瘤细胞系是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)，它本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性识别ＭＵＣ５ＡＣ的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为ＣＧＭＣＣＮＯ．１５０９、ＣＧＭＣＣＮＯ．１５１１的杂交瘤细胞产生。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许晔，胡明慧，
申请(专利权)人：中资汉脉北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]