一种适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法技术

本发明专利技术公开了一种适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法，采用以ＡＯＴ即二（２－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠为变性剂的非连续胶电泳系统，本系统能够快速有效地分离分子量在１－７０Ｋｄａ范围内的蛋白和多肽并测定其分子量，尤其适于分离分子量在１－１０Ｋｄａ的低分子多肽，具有较高地灵敏度和分辨率，且操作简便，耗时短，成本低。本系统克服了传统十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）不适于分离低分子多肽的缺陷，可广泛应用于低分子肽的分离纯化和分子量测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多肽电泳方法，尤其涉及，属生化分析

技术介绍
低分子活性多肽在医学研究中具有非常重要的意义，生物体的很多调节因子都是低分子多肽例如胰岛素、缓激肽、胸腺肽和促肾上腺皮质激素等。抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种有抗菌活性小分子多肽，已测序的抗菌肽达数百种，一般都由13～50个氨基酸组成，分子量小于5KDa。凝胶电泳技术是分析、分离和直接测定蛋白亚基和多肽单体分子量的有效方法。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，Laemmli改进的非连续胶系统以其高分辨率应用最为广泛。但是对分子量低于10Kda的多肽分辨率很低。目前国内外已报道的多种检测低分子量多肽的电泳方法，全是基于对SDS-PAGE系统的改进。例如增加甲叉双丙烯酰胺的浓度，即交联度C，并在分离胶中加入高浓度(8mol/L)的尿素；增加缓冲液的离子强度并配置梯度胶；在缓冲体系中添加吡啶，或者添加氨基酸；利用改进的Glycine-SDS-PAGE系统等。其中应用较广泛的是Schagger建立的Tricine-SDS-PAGE体系，它可以分离分子量为1-100KDa的蛋白质和多肽，但其分离系统比较复杂，需要配置灌注分离胶、间隙胶和浓缩胶三层凝胶，还需要不同的阴极、阳极电极缓冲液，电泳时间要10-20小时，且Tricine价格比较昂贵；大量电泳的结果表明Tricine-SDS-PAGE体系对分离小于3KDa的小肽效果不甚理想，多表现为带型弥散。总之，尽管人们对SDS电泳系统的改进做了大量的努力，但是，SDS电泳系统还是对低分子多肽的分辨率普遍较低，无法根本实现分离低分子多肽的目的。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供，该方法能够快速有效地分离分子量在1-70Kda范围内的蛋白和多肽并测定其分子量，尤其适于分离分子量在1-10Kda的低分子多肽，具有较高地灵敏度和分辨率，且操作简便，耗时短，成本低。可广泛应用于低分子肽的分离纯化和分子量测定。本专利技术所述适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法，采用以AOT即二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠为变性剂的非连续胶电泳系统，AOT分子量比SDS高，且有两条疏水链，与蛋白结合后，能明显降低低分子蛋白的迁移速率，减少低分子蛋白的扩散，这不仅有利于低分子蛋白在聚丙烯酰胺凝胶中的分离，而且能减少后续固定、染色和脱色过程中低分子蛋白质的扩散和流失。其特征是浓缩胶缓冲液1mol/LTris-HCl，pH6.8；分离胶缓冲液1.5mol/LTris-HCl，pH8.8；浓缩胶浓度为T＝3％，分离胶浓度为T＝10～16.5％，交联度C＝3％，并加入0.1％AOT和6mol/L尿素；所述胶的制备与一般SDS-PAGE电泳胶的制备方法相同；电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲系统，其配方为0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，pH8.3，并添加0.1％AOT；样品缓冲液(pH6.8)，其配方为1.6ml浓缩胶缓冲液+4ml 10％AOT+0.6g二硫苏糖醇+2.5ml87％甘油+0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20ml；其中含有的2％AOT能使多肽样品充分变性；变性条件依样品的分子量和性质，选用60℃孵育10min或75℃孵育10min或95℃孵育5min或者100℃煮沸3min；使用70mm*80mm*1mm的小胶板进行电泳；电泳条件将电极缓冲液注入电泳槽中，先60V恒压，待样品进入分离胶界面时，升电压至120V～140V，电泳时间1.5-2h；若使用160mm*160mm*1mm的大胶板进行电泳；电泳条件将电极缓冲液注入电泳槽中，先80V恒压，待样品进入分离胶界面时，电压升至160-200V电泳约10-12h。电泳完毕后将胶置于固定液(20％三氯乙酸)中固定1h，然后放置于染色液(0.29g考马斯亮蓝R-250+250ml脱色液)中染色过夜，转至脱色液(250ml95％乙醇+80ml冰醋酸+蒸馏水定容至1000ml)中脱色，并多次更换脱色液，直至胶背景清晰。上述的适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法中所述分离胶浓度为T＝12～14％时，更适于分离分子量为10KDa～70KDa范围内的蛋白和多肽。上述的适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法中所述分离胶浓度为T＝15～16.5％时，更适于分离分子量小于10KDa范围内的蛋白和多肽。上述的适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法中变性条件优选为75℃孵育10min或95℃孵育5min。上述的适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法中所述电泳条件优选为使用70mm*80mm*1mm的小胶板进行电泳，电泳条件将电极缓冲液注入电泳槽中，先60V恒压，待样品进入分离胶界面时，升电压至120V，电泳时间2h。使用160mm*160mm*1mm的大胶板进行电泳，电泳条件将电极缓冲液注入电泳槽中，先80V恒压，待样品进入分离胶界面时，电压升至180-200V电泳10h。下面通过SDS-尿素电泳与AOT-尿素电泳的比较来对本专利技术效果作进一步阐述在上述优选的制胶和电泳实验条件下，分别用AOT和SDS为变性剂，分离样品低分子肽标准分子量2512-16949Da(Pharmacia LKB)和胰岛素(5780Da)。实验结果表明在本专利技术所述AOT电泳体系中，低分子蛋白和多肽样品的迁移率明显比SDS电泳系统中要低，分辨率要高。AOT-PAGE电泳中，牛胰岛素解链为两条带，2Kda和3Kda的肽段很好的分开，带型清晰可辨，低分子量标准6条带均出现。而在同样条件下，SDS-PAGE电泳中，低分子量标准仅分出4条大分子带，6Kda以下得带均没有出现。牛胰岛素无法分离，只堆积在胶的前沿。AOT-PAGE电泳比SDS-PAGE电泳的灵敏度高得多。对于低分子量于10Kda的多肽，在AOT-PAGE中0.5-1μg多肽就能出现清晰的条带，而同样胶浓的条件下SDS-PAGE要2-3μg上样量才能出现同样清晰的条带。本专利技术所述的AOT-PAGE系统能很好地分离分子量在1-70KDa的蛋白和多肽样品。尤其使对分子量在1-10KDa低分子多肽具有较高地灵敏度和分辨率。其分子量对数与迁移率呈很好地线性关系(R2＝0.93)，可以较准确地测定低分子多肽的分子量。本专利技术的电泳方法操作过程简便，快速，成本低廉。所述的AOT-PAGE系统是进行低分子多肽研究的有力工具，可广泛应用于低分子肽的分离纯化和分子量测定。具体实施例方式实施例1分离分子量在1-70kDa的低分子肽标准分子量2512-16949 Da(Pharmacia LKB)浓缩胶浓度为T＝3％，分离胶浓度为T＝15％，C＝3％，并加入0.1％AOT和6mol/L尿素。电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲系统(0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，pH8.3)并添加0.1％AOT。变性条件为在pH6.8样品缓冲液中加2％AOT，100℃煮沸3min使样品充分变性。用70mm*80mm*1mm的小胶板进行电泳。电泳条件将电极缓冲液注入电泳槽中，先60V恒压，待样品进入分离胶界面时，升电压至120V电泳2h。用考玛斯亮蓝R-250染色系统固定、染色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适于分离低分子多肽的非连续胶电泳方法，采用以ＡＯＴ即二（２－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠为变性剂的非连续胶电泳系统，其特征是：浓缩胶缓冲液：１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ６．８；分离胶缓冲液：１．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．８；浓缩胶浓度为Ｔ＝３％，分离胶浓度为Ｔ＝１０～１６．５％，交联度Ｃ＝３％，并加入０．１％ＡＯＴ和６ｍｏｌ／Ｌ尿素；所述胶的制备与一般ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳胶的制备方法相同；电极缓冲液为Ｔｒｉｓ－甘氨酸缓冲系统，其配方为：０．０２５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，０．１９２ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸，ｐＨ８．３，并添加０．１％ＡＯＴ；样品缓冲液为ｐＨ６．８，其配方为：１．６ｍｌ浓缩胶缓冲液＋４ｍｌ１０％ＡＯＴ＋０．６ｇ二硫苏糖醇＋２．５ｍｌ８７％甘油＋０．１ｍｇ溴酚蓝，用双蒸水稀释到２０ｍｌ；其中含有的２％ＡＯＴ能使多肽样品充分变性；变性条件依样品的分子量和性质，选用６０℃孵育１０ｍｉｎ或７５℃孵育１０ｍｉｎ或９５℃孵育５ｍｉｎ或者１００℃煮沸３ｍｉｎ；使用７０ｍｍ＊８０ｍｍ＊１ｍｍ的小胶板进行电泳；电泳条件：将电极缓冲液注入电泳槽中，先６０Ｖ恒压，待样品进入分离胶界面时，升电压至１２０Ｖ～１４０Ｖ，电泳时间１．５－２ｈ；若使用１６０ｍｍ＊１６０ｍｍ＊１ｍｍ的大胶板进行电泳；电泳条件：将电极缓冲液注入电泳槽中，先８０Ｖ恒压，待样品进入分离胶界面时，电压升至１６０－２００Ｖ，电泳１０－１２ｈ；电泳完毕后，将胶置于固定液中固定１ｈ，然后放置于染色液中染色过夜，转至脱色液中脱色，并多次更换脱色液，直至胶背景清晰；其中所述固定液由２０％三氯乙酸配制；所述染色液配方为：０．２９ｇ考马斯亮蓝Ｒ－２５０＋２５０ｍｌ脱色液；所述脱色液配制方法为：２５０ｍｌ９５％乙醇＋８０ｍｌ冰醋酸＋蒸馏水定容至１０００ｍｌ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢雪梅，姚瑶，张为灿，高培基，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]