人巨细胞病毒重组蛋白质及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种人巨细胞病毒重组蛋白质及其制备方法，涉及基因工程技术和诊断试剂、疫苗研制领域。本发明专利技术提供的重组蛋白质是从Ｎ－末端到Ｃ－末端依次含有ＨＣＭＶ　　ｇｐ５２从Ｎ－末端第２６１位到第３８０位的１２０个氨基酸、ｐｐ１５０从Ｎ－末端第５８７位到第６４０位的５４个氨基酸、ｐｐ６５从Ｎ－末端第３６１位到４２５位的６５个氨基酸、ｇＢ从Ｎ－末端第２００位到２４３位的４４个氨基酸及ｐｐ２８从Ｎ－末端第９５位到１２８位的３４个氨基酸。该人巨细胞病毒重组蛋白质具有高特异性、强免疫原性蛋白质序列，可提高检测试剂的敏感性和特异性，且该重组蛋白质采取了多抗原决定簇串联的重组蛋白质技术，可以简化提纯过程，提高工作效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技术和诊断试剂、疫苗研制领域，特别是涉 及一种。
技术介绍
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,简称HCMV)属疱疹病 毒fi亚科，是一种DNA病毒，其感染在人群中广泛存在，我国人群中 巨细胞病毒感染相当严重。妇女在妊娠初期受CMV原发感染是引起胎 儿宫内感染和发育缺损的重要原因，在孕期原发性感染HCMV的胎儿 和新生儿中，80%可导致智力低下、畸形和死亡。 HCMV也是器官移植失败和艾滋病病人并发 感染死亡的主要原因之一。对非免疫缺陷者常导致长期隐性感染，甚 至引起感染细胞的转化、畸变或癌变等。因此快速准确的诊断HCMV病毒感染具有十分重 要的意义。目前巨细胞病毒感染诊断方法有脱落细胞及组织病理检查、病毒 分离、分子杂交试验和血清学检查，但由于前三种方法技术设备要求 高，检测周期长的局限性，无法广泛使用，而血清学检查具有简便快 速的特性使其在临床上得到广泛应用，目前大多检测试剂采用盒用的 HCMV蛋白质抗原主要是来源于病毒培养物或是重组表达的单一蛋白 片段，或者由于蛋白质抗原纯度低及特异性差，造成假阳性而降低检 测特异性；或者由于单一片段抗原蛋白所含抗原决定簇较少，所识别的抗体相应较少，易造成假阴性而降低检测敏感性，虽然多种单一片 段组合制备检测试剂也可以避免上述问题，但必然要求多次进行提取 纯化过程，而且小分子蛋白质或多肽的提纯技术要求更高，工作效率 太低。另外，在全球范围内，目前缺乏有效治疗病毒感染药物的情况下，通过接种疫苗预防病毒感染成为一种重要的医学干预手段，HCMV疫 苗的研制也是进行HCMV研究的重要领域之一，而疫苗研究的一个重 要前提是其所用蛋白质抗原应具有高特异性、强免疫原性和尽量完整 的抗原决定簇，因此开发一种多抗原决定簇串联的重组蛋白质技术是 十分必要的。
技术实现思路
鉴于以上问题，本专利技术的主要目的在于提供一种人巨细胞病毒重 组蛋白质及其制备方法，该专利技术利用重组聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction,简称PCR)技术构建出含有高度特 异性和强免疫原性的多抗原决定簇串联的人巨细胞病毒(H咖an Cytomegalovirus,简称HC匿)重组蛋白质。为达到以上目的，本专利技术提供的人巨细胞病毒重组蛋白质，其如 氨基酸残基序列SEQ ID No. 1所示所述的重组蛋白质从N-末端到 C-末端依次含有HCMV gp52从N-末端第261位到第380位的120个 氨基酸、ppl50从N-末端第587位到第640位的54个氨基酸、pp65 从N-末端第361位到425位的65个氨基酸、gB从N-末端第200位 到243位的44个氨基酸及pp28从N-末端第95位到128位的34个 氨基酸。其中上述重组蛋白质的DNA序列如SEQ ID No. 2所示，所述的 gp52目的肽段DNA序列是gp52第781位到第1140位核苷酸，ppl50 目的肽段DNA序列是第1759位到第1920位核苷酸，pP65目的肽段 DNA序列是第1081位到第1275位核苷酸，gB目的肽段DNA序列是第 598位到第729位核苷酸，pp28目的肽段DNA序列是第283位到第 384位核苷酸。本专利技术提供的人巨细胞病毒重组蛋白质制备方法，其基因重组及 纯化过程包括以下步骤(1) 设计用于扩增gp52目的DNA片段的PCR引物对(pl，p2)、 用于扩增ppl50目的DNA片段的PCR引物对(p3，p4)、用于扩增pp65 目的DNA片段的PCR引物对(p5，p6)、用于扩增gB目的DNA片段的 PCR引物对(p7，p8)和用于扩增pp28目的DNA片段的PCR引物对(p9，pl0)，引物pl和plO分别带有Ndel和XhoI的酶切位点，引物 p2和p3顺序互补，并共同对应于gp52上述片段的3'末端和ppl50 上述片段的5，末端序列，引物p4和p5顺序互补，并共同对应于 卯150上述片段的3，末端和pp65上述片段的5，末端序列，引物p6 和p7顺序互补，并共同对应于卯65上述片段的3，末端和gB上述 片段的5'末端序列，引物p8和p9顺序互补，并共同对应于gB上 述片段的3，末端和pp28上述片段的5，末端序列；(2) 以病毒培养物为模板，以引物Pl和P2扩增gp52片段，以 引物P3和P4扩增ppl50片段，以引物P5和P6扩增pp65片段，以 引物P7和P8扩增gB片段，以引物P9和P10扩增pp28片段；再以 第一轮PCR扩增得到的gp52片段和ppl50片段为模板，加入引物Pl 和P4，扩增gp52 ppl50片段，以第一轮PCR扩增得到的pp65片段 和gB片段为模板，加入引物P5和P8，扩增卯65gB片段；然后以第 二轮PCR扩增得到的gp52卯150和pp65gB片段为模板，加入引物Pl 和P8，扩增gp52ppl50pp65gB;最后以扩增得到的片段gp52 ppl50pp65gB和pp28为模板，加入引物Pl和PIO，扩增gp52 卯150卯65gB pp28，得到串联的目的基因重组片段gp52 ppl50pp65gB 卯28;(3) 将pET28a载体与PCR扩增产物经Ndel和Xhol双酶切，产 物纯化后经T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态， 涂布于含卡那霉素的LB平板上，37。C倒置培养过夜，次日挑选生长 的菌落，进行PCR和DNA测序鉴定，得到正确的阳性转化子；(4) 提取阳性转化子质粒，用化学转化法转入BL21系列中的 DE3感受态菌，在含卡那霉素的LB平板上370C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导 LB培养的表达菌株，诱导表达后收获菌体，经超声破菌、组氨酸亲 和柱和离子交换柱层析得到纯化的重组蛋白质。本专利技术提供的人巨细胞病毒重组蛋白质具有高特异性、强免疫原 性蛋白质序列，可提高检测试剂的敏感性和特异性，避免采用单一片 段抗原蛋白质时造成的假阴性而降低检测敏感性问题，且该重组蛋白 质采取了多抗原决定簇串联的重组蛋白质技术，可以简化提纯过程， 提高工作效率。另外，本专利技术提供的该重组蛋白质在人巨细胞病毒疫 苗研制领域也具有很好的实用价值。本专利技术所述的人巨细胞病毒重组蛋白质的氨基酸残基序列(SEQ ID No. 1):NH3-FAVENFLTEEPFQRGDPFDKNYVGNSGKSRGG G GGGGSLSSLANAGGLHDDGPGLDNDLMNEPMGL G GLGGGGGGGGKKHDRGGGGGSGTRKMSSGGGGG D HDHGLSSKEKYEQHKITSYAGAGAAITPTPVN P STAPAPAPTPTFAGTQTPVNGNSPWAPTAPPG D MNPANPQYSEHPTFTSQYRIQGKLEYRHTWDRH D EGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTG G GAAYHRDSYENKTMOMPDDYSNTHSTRYVTVK D QWHSRGSTWLYRRSTFREDKAPKPSKQSKKKKK P SKHHHHQQSSI M—C00H本专利技术所述的人巨细胞病毒重组蛋白质的DNA序列(SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人巨细胞病毒重组蛋白质，其特征在于，含有ＳＥＱＩＤＮｏ．１所示的氨基酸残基序列，所述的重组蛋白质从Ｎ－末端到Ｃ－末端依次含有人巨细胞病毒ｇｐ５２从Ｎ－末端第２６１位到第３８０位的１２０个氨基酸、ｐｐ１５０从Ｎ－末端第５８７位到第６４０位的５４个氨基酸、ｐｐ６５从Ｎ－末端第３６１位到４２５位的６５个氨基酸、ｇＢ从Ｎ－末端第２００位到２４３位的４４个氨基酸及ｐｐ２８从Ｎ－末端第９５位到１２８位的３４个氨基酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孔详菊，王志新，王健，陈廷友，张秀杰，
申请(专利权)人：北京英诺特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]