本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯衍生物修饰的亚血红素短肽化合物及制备方法。其是在用亚血红素六肽配制的水溶液中，加入磷酸盐缓冲溶液，然后加入活化的聚乙二醇衍生物固体粉末或聚乙二醇衍生物的乙腈溶液进行反应，将反应混合液采用反相高效液相色谱进行色谱分离，即可得聚乙二醇修饰的亚血红素六肽。本发明专利技术的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽能够基本保持亚血红素六肽的生物活性，同时比未修饰的亚血红素六肽有更好的稳定性。本发明专利技术的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽的制备方法简单易行。所述的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽，其结构通式如右，Ｒ代表去除一个氨基（ＮＨ↓［２］）的ＤｈＨＰ－６分子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯衍 生物修饰的亚血红素短肽化合物及制备方法。专利技术背景亚血素六肽(Deuterohemin-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys， DhHP-6)是以微酶和 天然抗坏血酸过氧化物酶结构为依据，设计的一种含亚血红素的短肽，是一种较 好的过氧化物酶模拟物。该短肽模拟酶分子量小于3000，可发展成高效的抗氧化 药物。但是，其生物利用率低，易受蛋白酶降解。单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯的衍生物，是以聚乙二醇为主链，并具有一 个甲氧基端基和一个活化的琥珀酰亚胺酯端基的高分子化合物。其中，聚乙二醇 (PEG)是一种亲水性、生物相容性的无毒聚合物，其通式为H (OCH2CH) nOH 其中n》4，其分子量为200至20000道尔顿不等。美国食品药品管理局(FDA) 已经批准了 PEG作为辅料，在食品，化妆品，及静脉注射，口服和经皮给药等 药物产品中的应用。同时，其能通过肝肾途径排出体外的特性，使其成为极为理 想的药用辅料。大量研究证明单甲氧基化形式的PEG与蛋白质和/或肽化学偶 联后，能显著延长后者的生物作用，许多PEG-蛋白和/或肽偶联物能够避免被蛋 白酶酶解，而且/或者能使自身的免疫原性降低。PEG及其衍生物作为药物制剂 的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用。制备蛋白质和/或肽和聚乙二醇结合物的最常用的方法是利用PEG活化后形 成的亲电子基团和蛋白质/多肽上的氨基进行反应，反应后可以在一个蛋白/多肽 分子上共价连接数个聚合物链，聚合物链的数目取决于蛋白质/多肽上可供结合 的位点数、修饰剂的化学性质，修饰剂的过量比例及反应条件。
技术实现思路
本专利技术的目的在于将亚血红素六肽(DhHP-6)用聚乙二醇(PEG)修饰，提 供一种。 DhHP-6分子，有如下结构式(I ):<formula>formula see original document page 5</formula>本专利采用的是目前广泛应用且已商品化的活化聚乙二醇衍生物，聚乙二醇的结构式如下(II):<formula>formula see original document page 5</formula>(II)本专利采用的活化聚乙二醇衍生物的结构通式如下(III):<formula>formula see original document page 5</formula>(III)其中聚乙二醇(PEG)的重均分子量为2000-20000 (相对应的，44《n《447)， k=0~3，(聚乙二醇的分子量过小，其在体内的代谢产物可能对人体有害，太大不 利于修饰，同时可能导致肽类药物失活)；通过亲核取代反应，制备一种聚乙二醇修饰的亚血红素六肽，其结构通式如 下(IV): O<formula>formula see original document page 5</formula>n k (IV)R代表去除一个氨基(NH2)的DhHP-6分子，具有如下结构(V):本专利技术描述的PEG修饰的DhHP-6的制备方法如下将DhHP-6溶于去离子水中配制成0.5~5mg/ml的溶液，向其中加入pH为 5 8的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，稀释至5 10倍体积，然后加入聚乙二醇衍生物 或10 40mg/ml聚乙二醇衍生物的乙腈(ACN)溶液，反应温度为0 25。C，反应 中聚乙二醇衍生物与DhHP-6的摩尔比为5~20: 1，反应时间为0.5~4小时，反 应结束后用甘氨酸终止反应，通过反相高效液相色谱接出PEG修饰的DhHP-6 洗脱峰，在4(TC下减压下旋转蒸发至无明显气泡产生，将残液冻干，即可得PEG 修饰的DhHP-6固体。反相高效液相色谱柱的流动相为A:H2O(含0.5。/。三氟乙酸(TFA， v/v))， B : 90%的乙腈水溶液(含0.5。/。三氟乙酸(TFA, v/v));浓度梯度为B相40%~60%， 时间为40分钟，(浓度由机器本身控制，初始状态时，水与乙腈的体积比为6: 4， 实验过程中，机器在设定的时间内，这里是40分种内将自动升高乙腈相体积比 并降低水相体积比，)，其中11分钟左右出现的洗脱峰为DhHP-6峰，15分钟左 右出现的洗脱峰为PEG修饰的DhHP-6的峰。CH2 CH2 COOH制备反应如下式进行<formula>formula see original document page 7</formula>其中R-NH2代表DhHP-6，聚乙二醇(PEG)的重均分子量为2000~20000 (44 《n《447)， k=0~3， R代表去除一个氨基(NH2)的DhHP-6分子；前文所述的聚乙二醇衍生物是本领域技术人员所熟知的，包括甲氧基聚乙 二醇琥珀酰亚胺酯或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇 琥珀酰亚胺酯等。本专利技术的优点在于1. 本专利技术所述的修饰方法简便。反应在室温下既可进行并且具有较高产 率。2. 本专利技术所述的聚乙二醇修饰的DhHP-6的用途是用于制备抗氧化药物， 抗衰老药物及治疗白内障的药物。3. 本专利技术所述的聚乙二醇修饰的DhHP-6能够基本保持DhHP-6的抗氧化 活性，同时它又比未修饰的DhHP-6有更好的稳定性。附图说明图1:是实施例1中在390nm检测波长下用Edipse XDB-C18柱分析DhHP-6 水溶液的层析图，其中，在指定的条件下，DhHP-6保留时间为 11.832min和12.116min;图2:是实施例1中在390nm检测波长下用Edipse XDB-ds柱分析聚乙二醇修饰的DhHP-6的层析图，其中，在指定的条件下，聚乙二醇修饰 的DhHP-6保留时间为15.057min;图3:是实施例2中在390nm检测波长下用Edipse XDB-C,8柱分析修饰反 应液的层析图，其中，11.887min时流出的为DhHP-6，其峰面积为 2734.47，占总峰面积的31.21%; 15.257min时流出的为聚乙二醇修 饰的DhHP-6的，其峰面积为6835.72，占总峰面积的68.79%;图4:是实施例2中DhHP-6的飞行时间质谱图，其中1497.5处单峰与DhHP-6 的1498的分子量符合；图5:是实施例2中PEG-DhHP-6的飞行时间质谱图，其中22000左右的连 续峰与聚乙二醇修饰的DhHP-6的分子量符合。具体实施方式实施例1:甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸脂(结构见通式，k=0， PEG的重均分子量 为20000， n"447) (m-SC-PEG20000)对亚血红素六肽(DhHP-6)的修饰反应温度的选择将DhHP-6固体粉末溶于去离子水中，配制成lmg/ml的 DhHP-6去离子水溶液，取4份O.lml DhHP-6的去离子水溶液(lmg/ml)，用pH=7 的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至lml，分别加入20mg m-SC-PEG20000 (后面指 的是摩尔比，摩尔比约等于(20/20000)/(0.1/1000) =10: 1)，完全溶解后，分别 置于O'本文档来自技高网...
【技术保护点】
聚乙二醇修饰的三价铁亚血红素短肽化合物，其结构通式如（Ⅳ）所式：Ｈ↓［３］Ｃ－（－ＯＣＨ↓［２］ＣＨ↓［２］－）↓［ｎ］－Ｏ－（－ＣＨ↓［２］－）↓［ｋ］－＊－ＮＨ－Ｒ（Ⅳ）其中，聚乙二醇的重均分子量为２０００～２００００，ｋ＝０～３，Ｒ代表去除一个氨基的ＤｈＨＰ－６分子，具有如（Ⅴ）式结构，＊＊＊（Ⅴ）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤钧，林航，李惟，王丽萍，杜创，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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