以亲和力层析法纯化血红素及改良血红素制造技术

本发明专利技术揭示有关一种借亲和力层析法（ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）技术纯化血红素之方法．与目前所相信的相反，氧及选择的多元阴离子与血红素之束缚并非互相独占的．新颖的方法包括制动一多元阴离子，它是特别的经其多元阴离子束缚处束缚血红素于一层析的凝胶，且经由凝胶把含溶液或混合物之血红素传送．因此，血红素被保留在凝胶中，而杂质从凝胶洗提出．此新颖方法亦可用于由一液体反应混合物含改良血红素及未改良血红素，把未改良血红素分离出来．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术系关于血红素基无细胞递氧体(hemoglobin-based acellular oxygen carriers)，尤其系一种藉亲和力层析法技术纯化血红素及改良的血红素。研究于发展无细胞递氧溶液以应用为一血液取代注重两方面，即血红素基之溶液及过氟碳物质(perfluorocarbon substances)如在必罗(Biro)之例子说明(Can.Med.Assoc.J，Vol.129，1983，Pp.237-244)。目前的工作已指示，过氟碳类为较不适合，原因是，例如，特别的临床条件为其应用上之需要及毒性问题。因此，现在的研究系集焦于潜在血红素基血液取代。因为血红素于溶液(而非它在自然发现于红血球中)在生理而言并非为满意递氧体，发展具有优良递氧及循环特征之血红素衍生物被委任。于本研究中血红素之主要来源是目前“落后”输血者“红血球在自然上含有丰富之血红素。从这此来源血红素之隔离藉数种方法而已达成，该等方法为牵涉从其他红血球细胞蛋白质及从细胞基质(cell stroma)之血红素分离方法。纯化血红素之标准技术为离子交换层析法(ion-exchange chromatography)。此技术已经很广泛的被用于分析(analytical)及诊断(diagnostic)应用(例如，参考Benesch and Benesch;Meth Enzymol.，Vol.76，PP，174-179，1981;及Hsia et al，J.Chromatog.，Vol.303，PP.425-428，1984)。然而，一种较迅速及特殊之纯化技术为亲和力层析法，它选择上隔离生物分子，藉其对某种分子、原子团、离子、或基称为配合基(ligands)而与生物分子形成复合物之束缚特殊性。一般上，在此技术中，配合基在一层析的凝胶上是制动的，而一含所需分子之溶液经由凝胶而传送。所需之分子是保留在凝胶上，是凭藉其特殊束缚配合基，而同时其他存在于此溶液之成份被洗提。已得晓，血红素特别的束缚小多元阴离子性分子，尤其是2，3-二磷酸甘油酸盐(2，3-diphosphoglycerate)(DPG)及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate)(ATP)，自然的存在于哺乳类红血球(Benesch and Benesch Nature，Vol，221;P.618，1969)。血红素之束缚处位置即束缚进行位置是位于或接近血红素之四聚物结构之中心(Arkone，A.，Nature，Vol.237，P.146，1972)。这些多元阴离子性分子束缚血红素于位置为重要的在于调整氧束缚亲和力，因多元阴离子性分子之束缚异形位阻上影响了血红素之组成进而引起这些和氧束缚亲和力之减少(Benesch and Benesch，Biochem，Biophys.Res.Comm.，Vol.26，P.162，1967)相反的，氧束缚于血红素异形位阻上减少了血红素对多元阴离子之亲和力。因此，氧血红素(Oxyhemoglobin)很弱的束缚DPG及ATP。这在奥卡大(Ogata)及麦康尼尔((Mcconnell)(Ann.N.Y.Acad.Sc.Vol.222，P.56，1973)描述之旋转标记ATP(spin-labelled ATP)束缚氧血红素及无氧血红素有表示。较特定的，上述多元阴离子性分子之束缚处是一般上介于血红素之B-血球蛋白(B-glebin)链之间，而可被认为是介于链之间的一“裂缝”。在红血球之自然条件下，这裂缝是由-DPG(于其醛类形式)之分子所占据。当血红素与氧束缚时以形成氧血红素，一结构重组形成而产生DPG由裂缝冒出而它被认为裂缝关闭之有效性。氧的一分子束缚该四聚物的血红素实际上增加其氧亲和力，以束缚至一第二、第三及第四个氧分子。以往，血红素的研究及尝试以制备无细胞溶液血红素以用于血液取代，曾揭露一广泛种类之多元阴离子性基及分子将在束缚处或裂缝处自然的由DPG所占据束缚。某种此研究，曾经是尝试的一部份以提供四聚物性血红素之B-键于溶液中之束缚以抵消(counteract)四聚物性血红素之不期望之倾向以解离成二聚物。在血细胞之自然血红素，此功能至少在某部份由裂缝里的DPG来满足，然而在溶液里，该DPG趋向由溶液扩散。于那些物质将会在裂缝束缚当做“DPG取代”为各种有机磷酸盐、二磷酸盐(diphosphates)及聚磷酸盐，例如吡哆醛磷酸盐(pyridoxal phosphate);磷酸类或核酸类例如ADP，ATP，嘌呤核苷(guanosine)磷酸盐，胞嘧啶磷酸盐(cytosine phosphates)，胸腺嘧啶磷酸盐(thymine phosphates)，尿嘧啶磷酸盐(uracil phosphate)等;肌醇磷酸盐(inositol phosphates)碳水化合物磷酸盐及硫酸盐;单碳水化合物及聚碳水化合物等。对于熟悉此技术者，有各种此类的束缚物质为习知的，及出版在相关之科学文献里。因为血红素的氧化作用而形成氧血红素有效的使血红素之多元阴离子性束缚处(“关闭裂缝”)不活泼，根据习知技术，是有必要开发血红素之多元阴离子束缚之特性，或的确进行调整氧束缚亲和力，是藉化学上改良多元阴离子束缚处，而该血红素为脱氧。然而，血红素存在于溶液中或混合物以基氧状况曝露于空气，i.e(氧)血红素。的确，很难维持血红素溶液于未氧化作用情况，经步骤涉到溶液与空气的接触，eg一层析步骤。因为此种难题，亲和力层析法之技术不曾用于习用上以纯化血红素。出乎意料的，它被发现(氧)血红素可利用亲和力层析法技术来隔离及纯化。当然，所描述的技术，可应用于未氧化作用血红素的隔离及纯化作用。本专利技术包含了利用亲和力层析法以隔离及从完整血液或其他来源或混合物之纯化，是凭藉血红素之可逆束缚经其多元阴离子束缚处至一多元阴离子制动于一层析的凝胶支持。此一发现允许了血红素在那状态之纯化，其中在正当试验室条件下它占优势。根据本专利技术，提供一种从含(氧)血红素溶液或混合物以隔离(氧)血红素的方法，包括(a)制止一特定束缚血红素由其多元阴离子束缚处之多元阴离子于层析的凝胶;及(b)经该凝胶传递含(氧)血红素溶液或混合物，其中该(氧)血红素是保留于凝胶中，而溶液或混合物的其他成份被洗提。尤其是，如果(氧)血红素溶液传过ATP-琼脂糖凝胶时(商业上可获得或以习知方法来制备)，它被观察到血红素是被凝胶所保留，而产生了被称为“红凝胶(red gel)”。在红凝胶中，血红素之氧束缚特征，就如由氧解离曲线(oxygen dissociation curve)所表示，是与其溶解ATP复合物(P50-35mmHg)相同而较在Bls-Tris缓冲剂溶液(P50-7mmHg)之血红素相同。因此，在红凝胶之血红素由ATP束缚异形位阻上改良至该多元阴离子处。另外一些证据，含任何各种竞争阴离子溶液的引入造成血红素由凝胶之洗提(elution)。这一些竞争阴离子，由递减的有效性之按次疗为肌醇己磷酸盐＞ATP 比哆醛磷酸盐 DPG＞二磷酸腺苷＞磷酸盐离子＞氯离子。除了红凝胶之氧解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由含（氧）血红素溶液或混合物隔离（氧）血红素之方法，包括：（ａ）制动一多元阴离子特定的束缚血红素经由其多元阴离子束缚处于一层析的凝胶；及（ｂ）经由凝胶传送该含（氧）血红素溶液或混合物，其中该（氧）血红素保留于凝胶上，而同时溶液或 混合之其他成份被洗提（ｅｌｕｔｅｄ）。

【技术特征摘要】
CA 1985-6-26 485.3921.一种由含(氧)血红素溶液或混合物隔离(氧)血红素之方法，包括(a)制动一多元阴离子特定的束缚血红素经由其多元阴离子束缚处于一层析的凝胶；及(b)经由凝胶传送该含(氧)血红素溶液或混合物，其中该(氧)血红素保留于凝胶上，而同时溶液或混合之其他成份被洗提(eluted)。2.一种由(氧)血红素溶液或混合物隔离(氧)血红素之方法，包括(a)提供一层析的凝胶它具有一制动多元阴离子，特定的经由其多元阴离子束缚处束缚血红素;及(b)经由凝胶传送含(氧)血红素溶液或混合物，其中(氧)血红素是选择上保留于凝胶上，而同时其他成份经由此传送。3.如权利要求第1项或第2项所述之方法，其中该多元阴离子由下列所选择，包括核苷三磷酸盐(nucleoside triphosphate)，1，3-二磷酸甘油酸盐(diphosphoglycerate)，一肌醇磷酸盐及一肌醇硫酸盐(inositol sulphate)。4.如权利要求前项所述之方法，其中该层析的凝胶是由下列所选择，包括了交联聚蔗糖凝胶(cross linked polysaccharide gels)及矽胶(silica gel)。5.如权利要求前项所述之方法，其中该多元阴离子是藉一疏水性化学空间群连接至层析的凝胶。6.如权利要求第5项所述之方法，其中该空间群是由下列之剂类选择，包括己二酸(adipic acid)，二氨基己烷及己二酸二肼(adipic acid dihydrazine)。7.如权利要求前项所述之方法，其中该多元阴离子是三磷酸腺苷(adenosine triphosphate)或肌醇四或戊磷酸盐。8.如权利要求前项所述之方法，其中该凝胶为琼脂糖凝胶(agarose gel)。9.如权利要求第8项所述之方法，其中所述化学空间群剂为己二酸。10.如权利要求第1项或第2项所述之方法，其中包括了随后之步骤(c)引入一阴离子进入层析的凝胶，它与在原有凝胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏仁长，
申请(专利权)人：希莫索尔公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]