本发明专利技术公开了一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法，首先将硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠盐、碳酸钠，微量元素溶液按比例配制成具鞘微鞘藻培养液；其次是将具鞘微鞘藻置于培养液中培养并制得具鞘微鞘藻粉；最后从具鞘微鞘藻粉中提取具鞘微鞘藻藻蓝蛋白并将其纯化。本发明专利技术所用方法易行、操作方便、安全可靠、产量高、产品质量好，且所用设备简单适用于工业化规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物
技术背景具鞘微鞘藻属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖体目、颤藻科、微鞘藻属。它是干旱、 半干旱地区生物结皮中的优势种群。目前，对具鞘微鞘藻的利用一般只停留在进 行人工藻结皮上，具鞘微鞘藻之所以用于形成人工藻结皮进行荒漠治理，主要的 是由于其富含藻蓝蛋白。藻胆蛋白是存在于某些藻类(主要是红藻和蓝藻)藻胆体 中的一类色素复合蛋白。藻胆蛋白具有强烈的荧光性，发橙红色荧光，而其本身 则呈红色、紫色或蓝色等，故为有色多肽。按光谱特性可把藻胆蛋白分成四类 藻红蛋白，藻蓝蛋白，藻红蓝蛋白和别藻蓝蛋白。藻蓝蛋白是其中的一类蓝色色 素蛋白。藻蓝蛋白除可用于植物光合作用研究外，还具有很高的应用开发价值 可作为纯天然的色素，用于食品、化妆品和染料等工业；试剂级藻蓝蛋白可制成 荧光试剂，应用于医学临床诊断和免疫学及生物工程等研究领域中；还可制成药 品用于医疗保健。目前在食品等行业中使用的蓝色素主要还是化学合成色素，而 天然蓝色素使用的很少，藻蓝蛋白大多是从螺旋藻和大型海藻中提取得到，它们 的藻蓝蛋白含量大都比具鞘微鞘藻的要低，另外，培养大型海藻的成本远比培养 具鞘微鞘藻的成本要高。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供。 为实现上述目的，本专利技术提供包括 如下步骤A、培养液的配制按每升水加入硝酸钠0.8 2.5g、磷酸氢二钾0.02 0.05g、硫酸镁0. 06 0. 09g、氯化钙0. 02 0. 05g、柠檬酸0. 004 0. 008g、柠 檬酸铁铵0. 004 0. 008g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001 0.003g、碳酸钠0.01~ 0. 04g，微量元素溶液0. 5 2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼 酸270 300mg、四水氯化锰170 200mg、七水硫酸锌18 25mg、 二水钼酸钠 15 30mg、五水硫酸铜6 10mg,完全溶解后搅匀制得培养液；B、 具鞘微鞘藻的培养首先是一级培养，将具鞘微鞘藻藻种接入培养液中通气培养，调节气流在1.5 3.5L.min—1，光强控制在65 85 u E. m-2. s-1，温度 控制在22 35'C，培养5 10天后转入到二级培养；其次是二级培养，将一级 培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养，调节气流在2.5 5L.mirT'， 无菌处理，光强控制在75 95u E.m—2. s—'，温度控制在22 35°C，培养5 10 天后转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到新的培 养液中通气培养，调节气流在3 6L.min—'，无菌处理，光强控制在70 100P E.m—2.s—'，温度控制在22 35'C，培养5 10天后作为继续培养的接种种 源；第四是继续培养，首先是小循环培养池培养，将三级培养后所得的藻种，接 入小循环培养池，控制温度在22 35°C，利用自然光进行光照，控制光照强度 在120 180n E.m—2.s—'，搅动培养基；其次是大循环培养池培养，将小循环培 养池中培养4 7天后的具鞘微鞘藻转接到大循环培养池中，小循环培养池与大 循环培养池中培养液的体积比为1:20 25，将大循环培养池中控制温度在22 35'C，利用自然光进行光照，控制光照强度在120 180u E.m-2.s-'培养10 20 天后的具鞘微鞘藻过滤收得具鞘微鞘藻藻浆；上述具鞘微鞘藻接种时，按每升培养液O. 1 0.5g湿重的比例接入。C、 具鞘微鞘藻粉的制备将藻浆经过离心获得具鞘微鞘藻藻泥，经浓縮、 脱水、干燥、粉碎后得到具鞘微鞘藻粉；D、 具鞘微鞘藻藻蓝蛋白的抽提向具鞘微鞘藻粉中加入7 10倍重量的 0. 05 0. lmol. L"，pH值为6. 0 8. 0的磷酸缓冲溶液，充分搅匀，然后置于-10 -2(TC下冰冻，待冻结后取出，置于20 30'C下融溶，待其完全融溶后，再将其 冰冻，如此反复冻融3 5次，然后3000 6000rpm离心10 15min，收集上清 液，即为藻蓝蛋白粗提液；E、 纯化在冰浴条件下，在藻蓝蛋白的粗提液中加入饱和度为50 70%的 硫酸铵避光盐析20 40min，然后在3 5。C下3000 6000rpra离心15 25min， 弃除上清液，用一倍体积的0.05 0. lmol.i;1， pH值为6. 0 8. 0的磷酸缓冲液 溶解沉淀物，避光透析20 30h后离心，取上清液用0.05 0. lmol.L-1， pH值 为6.0 8.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE — 52离子交换柱，并用0.05 0. lmol. L"， pH值为6. 0 8. 0的磷酸缓冲液和0. 1 0. 3mo1. L'1的NaCl溶液洗脱，用收集蓝色组分，冷冻干燥得纯化的藻蓝蛋白。本专利技术具有以下优点和卓著的效果方法易行、经济快捷、操作方便、产量 高、产品质量好、安全可靠，且所用设备简单适用于工业化规模生产。具体实施方式从具鞘微鞘藻提取藻蓝蛋白的具体实施步骤如下A、 培养液的配制按每升水加入硝酸钠1.5g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸镁0.075g、氯化钙0.036g、 柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001g、碳酸钠0.02g， 微量元素溶液lml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸286mg、 四水氯化锰181mg、七水硫酸锌22.2mg、二水钼酸钠25.2mg、五水硫酸铜7.9mg， 完全溶解后搅匀制得培养液。B、 具鞘微鞘藻的培养(1) 一级培养将具鞘微鞘藻种接入装有培养液的三角瓶(150 200ml)中， 静止培养或通气培养，通气培养时，调节气流大小在2.5L.min'1，气流经过棉花 球进行无菌处理，光强控制在70^iE.m—2.3—1，温度控制在30'C。当培养7 10天 后，转入到二级培养。(2) 二级培养将一级培养所得的培养物接入到装有培养液的培养瓶(500 1000ml)中，通气培养，调节气流大小在3L.mii!'1，无菌处理，光强控制在 8(HiE.m-2.s—1，温度控制在3(TC。当培养7 10天后，转入到三级培养。(3) 三级培养:将二级培养所得的培养物接入到装有培养液的培养瓶(5000 20000ml)，通气培养，调节气流大小在5L.min'1，无菌处理，光强控制在 90|aE.m-2.s"，温度控制在30'C。培养7 10天后，便可作为继续培养的接种种 源。(4) 继续培养① 小循环培养池(1 2m3)培养采用三级培养后所得的藻种，接入小循环 培养池。采用玻璃温棚控制温度在30'C，利用自然光进行光照，采用遮荫网控 制光照强度在120 18(HiE.m—^s'1，叶轮或潜水泵搅动培养基。② 大循环培养池(40 60m3)培养将小循环培养池中培养4 7天的具鞘 微鞘藻转接到大循环培养池中，小循环培养池与大循环培养池中培养液的体积比为1:20 25，其他培养条件与小循环培养池的培养条件相同。上述具鞘微鞘藻接种时，按每升培养液O. 1 0.5g湿重的比例接入。C、 具鞘微鞘藻粉的制备将大循环培养池中培养15 20天后的具鞘微鞘藻用泵抽到过滤装置——振 动斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得具鞘微鞘藻藻浆，然后将藻浆经过离本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤： Ａ、培养液的配制：按每升水加入硝酸钠０．８～２．５ｇ、磷酸氢二钾０．０２～０．０５ｇ、硫酸镁０．０６～０．０９ｇ、氯化钙０．０２～０．０５ｇ、柠檬酸０．００４～０．００８ｇ、柠檬酸铁铵０．００４～０．００８ｇ、乙二胺四乙酸二钠盐０．００１～０．００３ｇ、碳酸钠０．０１～０．０４ｇ，微量元素溶液０．５～２ｍｌ，其中微量元素溶液按每１００ｍｌ蒸馏水中加入硼酸２７０～３００ｍｇ、四水氯化锰１７０～２００ｍｇ、七水硫酸锌１８～２５ｍｇ、二水钼酸钠１５～３０ｍｇ、五水硫酸铜６～１０ｍｇ，完全溶解后搅匀制得培养液； Ｂ、具鞘微鞘藻的培养：首先是一级培养，将具鞘微鞘藻藻种接入培养液中静止培养或通气培养，调节气流在１．５～３．５Ｌ．ｍｉｎ↑［－１］，光强控制在６５～８５μＥ．ｍ↑［－２］．ｓ↑［－１］，温度控制在２２～３５℃，培养５～１０天后转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养，调节气流在２．５～５Ｌ．ｍｉｎ↑［－１］，无菌处理，光强控制在７５～９５μＥ．ｍ↑［－２］．ｓ↑［－１］，温度控制在２２～３５℃，培养５～１０天后转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养，调节气流在３～６Ｌ．ｍｉｎ↑［－１］，无菌处理，光强控制在７０～１００μＥ．ｍ↑［－２］．ｓ↑［－１］，温度控制在２２～３５℃，培养５～１０天后作为继续培养的接种种源；第四是继续培养，首先是小循环培养池培养，将三级培养后所得的藻种，接入小循环培养池，控制温度在２２～３５℃，利用自然光进行光照，控制光照强度在１２０～１８０μＥ．ｍ↑［－２］．ｓ↑［－１］，搅动培养基；其次是大循环培养池培养，将小循环培养池中培养４～７天后的具鞘微鞘藻转接到大循环培养池中，将大循环培养池中控制温度在２２～３５℃，利用自然光进行光照，控制光照强度在１２０～１８０μＥ．ｍ↑［－２］．ｓ↑［－１］培养１０～２０天后的具鞘微鞘藻过滤收得具鞘微鞘藻藻浆； Ｃ、具鞘微鞘藻粉的制备：将藻浆经过离心获得具鞘微鞘藻藻泥，经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到具鞘微鞘藻粉； Ｄ、具鞘微鞘藻藻蓝蛋白的抽提：向具鞘微鞘藻粉中加入７～１０倍重量的０．０５～０．１ｍｏｌ．Ｌ↑［－１］，ｐＨ值为６．０～８．０的磷酸缓冲溶液，充分搅匀，然后置于－１０～－２０℃...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢作明，刘永定，王焰新，沈银武，胡春香，
申请(专利权)人：中国地质大学武汉，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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