消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种消减免疫法制备大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７抗原单克隆抗体的方法，步骤为：（１）选ＢＡＬＢ／ｃ小鼠；（２）用除大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７以外的大肠杆菌为耐受原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，在注射耐受原后，腹腔注射环磷酰胺，检测小鼠耐受情况；（３）隔两周重复步骤（２），直至ＢＡＬＢ／ｃ小鼠对耐受原耐受；（４）在使ＢＡＬＢ／ｃ小鼠出现耐受后，以大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取与耐受原反应效价低而与大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的单克隆抗体。本发明专利技术的方法在不纯化抗原的基础上，较易获得细菌抗原的单克隆抗体，提高免疫效果，减少单抗筛选工作量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备单克隆抗体的免疫方法，特别是涉及一种消减免疫法制备大肠杆 0157:H7抗原单克隆抗体的方法。技术背景1975年Kohler和Milstein发表了"分泌预定特异性抗体融合细胞的持续培养"的论文， 单克隆抗体技术从此问世。单克隆抗体技术已是现代生命科学研究的重要工具。常规的杂 交瘤技术通常并不能获得特定目的抗原的单克隆抗体。常规技术制备细菌抗原单克隆抗体， 通常采用生物化学方法分离纯化天然蛋白质作为免疫原，然后将免疫小鼠的脾细胞与骨髓 瘤细胞进行融合，用免疫原筛选出分泌抗目的蛋白抗体的细胞株。由于绝大部分的天然蛋 白表达量很低，用生物化学方法分离纯化难度大，成本高，现己很少使用。利用基因工程 技术可表达目的蛋白质，但此方法存在制备周期长和抗体亲合力相对较弱等不足之处，主 要原因是因为大多数蛋白质都采用大肠杆菌表达系统，表达蛋白后无修饰，不具备天然蛋 白的构象，尤其对那些需要糖基化、磷酸化等修饰作用的蛋白。实验证明用某些原核表达 蛋白免疫动物制备的抗血清只能与变性蛋白反应，而很难结合天然抗原，这种现象在用杆 状病毒表达的蛋白中也存在。尽管这类抗体能用于Western Blot实验，但研究天然蛋白的 结构与功能及对病原微生物的检测则受到很大的限制。而用真核表达系统如酵母、昆虫和 哺乳类动物细胞表达蛋白质，存在着实验周期更长、表达产量更低、技术难度更大等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种使免疫系统直接耙向目的抗原决定 簇，来大幅增加目的抗原单抗的产生数目，并减少单抗筛选的工作量的消减免疫法制备大 肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法。本专利技术的技术方案概述如下消减免疫法制备大肠杆菌0157:H7抗原单克隆抗体的方法，包括如下步骤 (1 )选取4-8周龄雌性BALB/c小鼠；(2) 用除大肠杆菌0157:H7以外的、已分离鉴定的、商品化的大肠杆菌为耐受原腹腔 注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐受原的6-16min、 18-30 h和40-60 h，按每 公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺50-150 mg，用间接ELISA检测小鼠耐受情 况；(3) 每隔两周重复步骤(2)，直至BALB/c小鼠对所述耐受原耐受；(4) 在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的7-14d、 14-21d、 28-35d，以大肠 杆菌0157:H7为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大肠杆菌0157:H7末次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而与大肠杆菌 0157:H7反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体。 所述歩骤(1)优选的是选取5-6周龄雌性BALB/c小鼠。所述步骤(2)为用除大肠杆菌0157:H7以外的、己分离鉴定的、商品化的大肠杆菌 为耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分别在注射所述耐受原的8-12 min、 22-26 h和 46-50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠体重腹腔注射环磷酰胺50-150 mg，用间接ELISA检测小鼠耐受情况。所述除大肠杆菌0157:H7以外的、已分离鉴定的、商品化的大肠杆菌为大肠杆菌44752、 大肠杆菌44186、大肠杆菌44824、大肠杆菌44336或大肠杆菌44102，还可以选用其它的 大肠杆菌。所述步骤(4)为在使所述BALB/c小鼠出现耐受的末次免疫后的9-lld、 16-18d、 30-32d ，以大肠杆菌0157:H7为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的BALB/c小鼠， 在用所述大肠杆菌0157:H7末次免疫3d取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而 与大肠杆菌0157:H7反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌0157:H7的单克 隆抗体。本专利技术的方法可在不纯化抗原的基础上，较容易的获得细菌抗原的单克隆抗体；本发 明的方法能提高免疫效果，减少单抗筛选的工作量获得预期的单克隆抗体。 附图说明图1为常规免疫法杂交瘤技术示意图； 图2为消减免疫法杂交瘤技术示意图； 图3为BALB/c获得了对大肠杆菌44752的耐受情况；图4为消减免疫效果。具体实施方式本专利技术的方法中，由于BALB/c小鼠在注射耐受原后注射烷化剂环磷酰胺，使得BALB/c 小鼠对耐受原表面暴露的抗原决定簇耐受，注射免疫原后，BALB/c小鼠选择性的针对免疫 原表面特有的抗原决定簇发生免疫反应，特异性抗体随之产生。本专利技术用的菌体抗原免疫 和筛选，这有利于得到抗天然构象蛋白质的单克隆抗体，有利于单克隆抗体与不同分离毒 株的结合，减少应用中可能受到的限制。下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。常规杂交瘤技术(见图l)为免疫小鼠后直接进行融合筛选，由于菌体为细胞型抗原，其 抗原决定簇十分丰富，并且与其同种属的细菌有严重的交叉反应，致使筛选菌体特异性单 克隆抗体的工作量巨大；而消减免疫使部分相同的抗原决定簇在体内被抑制，从而减少单 抗筛选的工作量，增加获得预期的抗体的机会(见图2)。消减免疫法可排除针对非本细菌特异性抗原单克隆抗体株。从而巧妙的回避了没有比 较纯的抗原的问题，使得试验成功排除了很多非特异性单抗，获得与其他相近属的菌种不 产生交叉反应的单抗株。并且采用菌体抗原免疫可以避免小分子蛋白免疫原免疫效果不佳、产生的抗体不稳定等弊端，从而使试验获得的单抗具有很好的稳定性。实施例1制备抗原生理盐水溶解冻干菌种大肠杆菌0157:H7、大肠杆菌44752，接种于营养肉汤培养基 37。C培养18h，然后划线接种于选择性培养基(远藤培养萄37。C培养18h，挑选其中的典型 菌落，接种于营养琼脂培养基上，37C培养18h，用PBS洗下菌落，4000r/min离心20min， 用PBS洗涤2次后经0.4n/。甲醛固定，配制为抗原浓度为108cfu/mL的菌悬液，4'C保存。 消减免疫法免疫小鼠消减免疫法免疫BALB/c小鼠的步骤消减免疫法以大肠杆菌44752为耐受原，大 肠杆菌0157:H7为免疫原，采用5-6周龄雌性BALB/c小鼠。先用耐受原腹腔注射0.5mL 抗原免疫小鼠，分别在注射耐受原后10min， 24h和48h，再腹腔注射环磷酰胺(Cy) (100 mg/kg体重)；每次免疫后三天后眼睚静脉丛采血，间接ELISA检测小鼠耐受情况，每隔两 周重复此免疫及检测过程，直至小鼠对耐受原耐受。然后，再用免疫原在免疫耐受阶段末 次免疫后10d、 17d、 31d免疫小鼠，依次腹腔注射免疫原0.2mL， 0.5mL， 0.8mL。末次免 疫3d时取鼠尾血检测效价，取与大肠杆菌44752反应效价低而与大肠杆菌0157:H7反应 效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备免疫原的单克隆抗体。免疫耐受阶段，以常规免疫方法免疫大肠杆菌44752菌体抗原作为对照，平行地每次 免疫0.5mL抗原。在免疫3天后，取小鼠眼眶血检测，看受试小鼠是否获得耐受，动物耐 受则进入免疫阶段。耐受后免疫阶段，以常规免疫方法免疫大肠杆菌0157:H7菌体抗原作为对照，平行地 依次免疫0.2mL,0.5mL，0.8mL。在末次免疫后3天，取鼠尾血检测效价，取效价高的小鼠进 行本文档来自技高网...

【技术保护点】
消减免疫法制备大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７抗原单克隆抗体的方法，其特征是包括如下步骤：（１）选取４－８周龄雌性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠；（２）用除大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７以外的、已分离鉴定的、商品化的大肠杆菌为耐受原腹腔注射免疫所述ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，分别在注射所述耐受原的６－１６ｍｉｎ、１８－３０ｈ和４０－６０ｈ，按每公斤所述ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体重腹腔注射环磷酰胺５０－１５０ｍｇ，用间接ＥＬＩＳＡ检测小鼠耐受情况；（３）每隔两周重复步骤（２），直至ＢＡＬＢ／ｃ小鼠对所述耐受原耐受；（４）在使所述ＢＡＬＢ／ｃ小鼠出现耐受的末次免疫后的７－１４ｄ、１４－２１ｄ、２８－３５ｄ，以大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７为免疫原腹腔注射免疫所述对耐受原耐受的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，在用所述大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７末次免疫３ｄ取鼠血检测效价，取与所述耐受原反应效价低而与大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７反应效价高的小鼠按照常规杂交瘤技术制备大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李君文，郎婧，金敏，谌志强，王新为，陈照立，邱志刚，王景峰，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]