本发明专利技术属于医药生物技术领域，涉及来自肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７志贺毒素ⅡＢ表位肽及其应用，其中优选的４个多肽来自ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７志贺毒素ⅡＡ１亚单位（Ｓｔｘ２Ａ１）的Ｂ细胞表位本发明专利技术所述肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７志贺毒素ⅡＢ表位肽可用于制备诊断和治疗ＥＨＥＣ Ｏ１５７感染及其并发症方面药物中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药生物
，尤其涉及肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素IIB表位肽及其应用。
技术介绍
肠出血性大肠杆菌(EHEC) (M57:H7为重要的新发人畜共患传染病原, 其引发的食物中毒在世界各地包括中国均有大规模的暴发流行。2006年在 美国爆发的波及26个州的毒菠菜事件就是由该菌污染所致，1999年末至 2000年初，在我国东部部分地区发生了迄今为止世界上最大规模的 0157:H7感染爆发流行，因此，该菌的感染己经成为一个全球性的公共卫 生问题。由于EHEC0157:H7菌培养容易、感染力强、传播途径多样，使 0157菌极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。美国疾 病控制中心(CDC)己将EHEC0157菌列为B类生物恐怖病原体严加防 范。此外，EHEC0157:H7菌的烈性致病因子还有可能用于新型生物武器 ——^S因武器的构建。然而目前对其感染尚缺乏有效的防治方法。研究证明抗生素可促使 0157菌释放致死性志贺毒素(Shiga toxin , Stx)，从而使患者病情加重。 2002年中国国家卫生部制定的"肠出血性大肠杆菌0157:H7感染性腹泻应 急处理预案(试行)"第5条规定肠出血性大肠杆菌0157:H7病人和疑似 病人禁止使用抗生素。因此，无论从公共卫生还是生物反恐的需要出发， 探索新的治疗手段迫在眉睫。研究表明志贺毒素II (Stx2)是0157: H7主要的致病因子。Stx2 进入血液循环后，可引起靶组织器官，如肾小球和结肠内皮细胞的损伤， 最终导致溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重 并发症的发生。因此，Stx2是目前治疗0157: H7菌感染的药物研究的主要 耙标。Stx2毒素由1个A亚基(32KDa)和5个B亚基(7.7KDa/单体)组成。Stx2 通过B亚基与受体Gb3结合后，进入细胞内质网A亚基被裂解为Al和 A2两个片段后，Al片断经内质网进入细胞质作用真核生物核糖体 28SrRNA，导致蛋白质合成停止。这种作用会导致肾内皮细胞、肠上皮细 胞、Vero细胞、Hela细胞或其他任何具有Gb3受体的细胞的死亡。鉴于Stx2的结构和致病其机理，针对Stx2的药物研究主要集中在Stx2 的疫苗和中和性抗体的研究，但目前国内外尚无Stx2的疫苗和中和性抗 体上市。鉴于以上研究背景本专利技术预测并和成了 Stx2Al毒性亚单位上的B细 胞表位，并对预测的B细胞表位的免疫原性和免疫保护性进行了鉴定，本 专利技术的B细胞表位肽可用于EHEC 0157:H7感染的肽疫苗研究和利用B 细胞表位肽制备Stx2特异的单克隆抗体诊断和治疗0157:H7的感染。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种来自肠出血性大肠杆菌0157:H7 Stx2 Al毒性亚单位的B细胞表位肽，其具有下述氨基酸序列中的至少一种1) SEQIDNO:l、 SEQ ID NO:2 、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；2) 将所述SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2 、 SEQIDNO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加 而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列。本专利技术的另一目的是提供一种编码上述的来自肠出血性大肠杆菌 0157:H7 Stx2 Al毒性亚单位上的B细胞表位肽的核苷酸序列，其具有下 述核苷酸序列中的至少一种1) SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6 、 SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8 所示的核苷酸序列；2) 与所述SEQIDNO:5、 SEQIDNO:6 、 SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供上述的来自肠出血性大肠杆菌0157:H7志 贺毒素IIA1亚单位的B细胞表位肽的应用，其可用于制备预防或治疗肠 出血性大肠杆菌感染的药物组合物，或制备单克隆抗体。本专利技术所述的预防或治疗肠出血性大肠杆菌感染的药物，其包含上述 的来自肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素II Al亚单位的B细胞表位肽 和药学上可接受的载体，其中上述的药学上可接受的载体包含稀释剂、赋 形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸 附载体中的至少一种。如本专利技术的B细胞表位肽可以与佐剂不耐热肠毒素 一起组成药物制剂后口服,与铝佐剂一起组成药物制剂静脉输注射。本专利技术所述的另外一种可预防或治疗肠出血性大肠杆菌感染的疫苗 组合物，其也包含上述的来自肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素IIA1 亚单位的B细胞表位肽。本专利技术的B细胞表位肽及其药物制剂可用于预 防和治疗肠出血性大肠杆菌0157:H7感染所致出血性肠炎；溶血性尿毒综 合征及血栓性血小板减少紫癜。本专利技术的思路如下首先基于Stx2与配体腺嘌呤相互作用的晶体结 构，按B细胞表位的预测原则，对包含毒性活性位点的Stx2Al亚单位的 氨基酸序列进行分析，预测Stx2Al的B细胞表位，并采用DNAStar软件 分析评价，人工合成B表位肽，用合成的B细胞表位肽偶联载体蛋白钥 孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin， KLH)后免疫日本大耳兔，鉴定 其免疫原性；Dot ELISA和Western blot鉴定兔抗血清的特异性，获得了 4条B细胞表位肽；用4条B细胞表位肽分别免疫Balb/c小鼠，以天然 Stx2攻毒，鉴定4条B细胞表位肽的免疫保护性，结果显示P1B细胞 表位肽能刺激机体产生中和Stx2的抗体，该肽段位于Stx2Al片段N端第 53 80位氨基酸，包含Stx2的毒性活性位点一位于Stx2Al片段N端77 位上的酪氨酸。本专利技术的B表位肽可以用来研制人或小鼠用的0157: H7 的肽疫苗，可以用来开发预防或治疗EHEC 0157:H7感染的多肽药物。本专利技术经过深入而广泛的研究，基于EHEC 0157:H7的Stx2蛋白的 晶体结构，辅以DNAStar软件分析，选择性的合成了 4条可能诱导机体产 生体液免疫应答的B细胞表位肽，并对其免疫特性进行评价，发现此4 条表位肽能够在Balb/c小鼠体内诱导特异性的体液免疫应答，产生的抗血 清均能与Stx2蛋白发生特异性结合。因此，此四条多肽可以用于EHEC 0157:H7的多表位肽疫苗的设计；本专利技术的4条多肽可以用于人及动物用 的疫苗及药物的开发。为让本专利技术的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举 较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。附图说明图1A-图1B表示斑点酶联免疫吸附试验鉴定兔抗血清的特异性A.斑点酶联免疫吸附试验包被抗原的示意图；B.斑点酶联免疫吸附 试验结果1. PIB表位肽兔抗血清2. P2 B表位肽兔抗血清3. P3 B表位肽兔抗血清4. P4 B表位肽兔抗血清5. 正常兔血清；6. PBS空白对照图2表示免疫印迹鉴定兔抗血清的特异性1. 阴性兔血清的免疫印迹2. PI B表位肽兔抗血清的免疫印迹3. P2 B表位肽兔抗血清的免疫印迹4. P3 B表位肽兔抗血清的免疫印迹5. P4 B表位肽兔抗血清的免疫印迹；具体实施例方式下面结合具体实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来自肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７志贺毒素Ⅱ Ａ１亚单位的Ｂ细胞表位肽，其特征在于具有下述氨基酸序列中的至少一种：１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示的氨基酸序列；２）将所述ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹全明，罗萍，毛旭虎，曾浩，石云，郭刚，张卫军，刘璐，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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