一种中和肠出血性大肠杆菌0157：H7志贺毒素Ⅱ的单克隆抗体、Fab抗体与应用制造技术

本发明专利技术属于医药生物技术领域，具体地说，本发明专利技术是关于一种具有中和肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７志贺毒素Ⅱ的单克隆抗体、Ｆａｂ抗体序列与应用，所述的单克隆抗体由保藏号为ＣＣＴＣＣ：Ｃ２００８２２的杂交瘤细胞株制备。本发明专利技术所述抗体可用于制备诊断和治疗ＥＨＥＣ　Ｏ１５７感染及其并发症方面药物中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物
，具体说涉及中和肠出血性大肠杆菌0157: H7志贺毒素 II的单克隆抗体、Fab抗体及其应用。
技术介绍
肠出血性大肠杆菌(EHEC) 0157:H7的感染是一个全球性的公共卫生问题。其引发的食物 中毒在世界各地均有大规模的暴发流行。2006年在美国爆发的波及26个州的毒菠菜事件就 是由该菌污染所致，1999年末至2000年初，在我国东部部分地区发生了迄今为止世界上最 大规模的0157:H7感染爆发流行。由于该菌培养容易、感染力强、传播途径多样，使其极有 可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。美国疾病控制中心(CDC)已将EHEC 0157菌列为B类生物恐怖病原体严加防范。此夕卜，EHEC0157:H7菌的烈性致病因子还有可 能用于新型生物武器——基因武器的构建。然而目前对其感染尚缺乏有效的防治方法。研究证明抗生素可促使0157菌释放致死性 志贺毒素(Shigatoxin，Stx),从而使患者病情加重。因此，无论从公共卫生还是生物反恐的 需要出发，探索新的治疗手段迫在眉睫。研究表明志贺毒素II (Stx2)是0157: H7主要的致病因子。Stx2进入血液循环后，可 引起靶组织器官，如肾小球和结肠内皮细胞的损伤，最终导致溶血性尿毒综合征(HUS)及血 栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症的发生。Stx2致病是急剧快速的，因此针对Stx2的中 和性抗体在0157:H7感染的紧急治疗中将发挥重要作用，但目前国内外尚无Stx2中和性抗体上市。由于鼠源单抗可在人体内引起人抗鼠抗体反应；完整的单抗分子量大，组织摄取百分数 较低，体内半衰期较长，因而使其在人体内的应用受到限制。基因工程抗体技术的发展使人 们可以在基因水平上改造抗体结构，以满足用于人体治疗的抗体需低免疫原性、髙特异性、 高稳定性、和高亲和力的要求。对鼠源性抗体进行人源化改造，或构建主要保留抗体可变区 的小分子抗体，如Fab及ScFv，既可降低分子量亦可降低异源性，同时还保留有抗原结合活 性，将有利于鼠单抗在人体内应用。Fab抗体保留了全抗体的轻链和重链的可变区及第一恒 定区(VH+CH1)，分子量仅为全抗体的三分之一，大大降低了抗体的鼠原性。与ScFv抗体相 比，Fab抗体在体内半衰期较长、稳定性好、保留了与亲代抗体较为接近的亲和力，这对发 挥中和毒素作用的治疗性抗体而言尤为重要。 〈
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种中和肠出血性大肠0157:H7的志贺毒素II的单克隆抗体， 其由保藏在以下单位的杂交瘤细胞株制备保持单位为中国典型培养物保持中心，地址为湖 北省武汉市武昌珞珈山武汉大学,保藏日期为2008年5月27日，保藏号为CCTCC:C200822, 杂交瘤细胞体系为1F2。本专利技术的另外一个目的是提供上述的单克隆抗体制得的Fab抗体，其包括k链和Fd链。所述的k链具有SEQ ID NO:l所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO:l所示的氨基酸序 列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序 列的任一种。所述的k链的核苷酸序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO:2所 示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。所述的Fd链具有SEQ ID NO:3所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO:3所示的氨基酸 序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸 序列的任一种。所述的Fd链的核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO:4 所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。本专利技术提供上述的Fab抗体的制备方法，其主要包括以下步骤1) 提取所述杂交瘤细胞的总RNA，获得RNA;2) 以步骤l)中的RNA为克隆模板，克隆所述单克隆抗体的k链和Fd链基因；3) 将步骤2)获得的k链和Fd链基因克隆到T载体中，进行鉴定；4) 将步骤3)获得的k链和Fd链基因克隆到分泌表达Fab抗体的载体中，进行表达、 鉴定、纯化，得所述的的Fab抗体。本专利技术还提供一种表达载体，其含有上述的k链和Fd链的核苷酸序列。本专利技术所述的表达载体，可以包括裸DNA或质粒DNA中的至少一种。本专利技术还提供一种表达宿主，其中转入含有上述的k链和Fd链的核苷酸序列的表达载体。本专利技术还有一个目的是提供上述的Fab抗体的应用，其可用于制备预防或治疗肠出血性 大肠杆菌感染的药物，该药物可包含上述Fab抗体和药学上可接受的载体，其中上述的药学 上可接受的载体包含稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表 面活性剂、吸附载体中的至少一种。本专利技术所述的Fab抗体还可用于制备ScFv抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体融合 蛋白、蛋白单域抗体，具体来说，1)嵌合抗体是用鼠单抗的V区与人IgG的C区连接而 成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保留了鼠单抗的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等 不良反应；2)人源化抗体是针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨 基酸残基修饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等从而降低了可变区的鼠源性同时又 保持了鼠单抗的特异性和亲和力；3)单域抗体由VH或VL—个功能结构域组成的单域抗 体、由单个CDR构成的最小识别单位等；4)双特异性抗体是一类具有双重特异性和双重 功能的抗体，又称双功能抗体；5)重组抗体融合蛋白把Fab基因片段，与非抗体的毒素或 酶等其它蛋白基因连接形成的具有特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。本专利技术的思路如下采用来自Stx2Al亚单位的保护性B细胞表位肽Pl(53 8(p为抗原(该肽包含Stx2Al上的毒性活性中心)，靶向性制备中和Stx2毒性活性中心的MAbs，并通过抗 体的生物学鉴定证实单抗的预防和治疗作用。在此基础上，利用基因工程技术对这株中和性 MAb进行Fab抗体的改造，构建具有中和Stx2毒性的Fab抗体，对Fab抗体的基因结构和 蛋白质的序列进行分析，并对Fab抗体中和Stx2毒性的作用进行了鉴定。本专利技术的Fab抗体 的重链Fd片段和k轻链基因和多肽可以用来开发预防或治疗EHEC 0157:H7感染的抗体药 物。本专利技术利用来自Stx2Al亚单位的保护性B细胞表位肽Pl(53 8o)为抗原制备的1F2单克 隆抗体能中和Stx2蛋白的毒性作用，将lF2单克隆抗体制备成Fab基因工程抗体，动物实验 显示具有良好的Stx2毒性中和作用。基于P1B表位肽制备的1F2单克隆抗体的Fab形式的抗 体对0157: H7感染具有潜在的预防和作用。为让本专利技术的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配 合附图，作详细说明如下。附图说明图1表示1F2单克隆抗体的免疫印迹；图2表示琼脂糖电泳检测总RNA;图3表示琼脂糖电泳检测k轻链PCR产物M. DNA Marker箭头所示为k轻链图4表示琼脂糖电泳检测Fd链PCR产物M. DNA Marker箭头所示为Fd链图5表示PM18T-1F2k和PM18T-lF2Fd质粒酶切鉴定MDNA Marker1~2.箭头所示为Fd链，3~本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中和肠出血性大肠Ｏ１５７：Ｈ７的志贺毒素Ⅱ的单克隆抗体，其特征在于由保藏号为ＣＣＴＣＣ：Ｃ２００８２２的杂交瘤细胞株制备。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邹全明，罗萍，曾浩，毛旭虎，石云，张卫军，刘璐，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]