唐古特大黄药材ＤＮＡ提取方法技术

本发明专利技术提供一种从唐古特大黄药材提取ＤＮＡ的方法，该方法是将唐古特大黄干药材用蒸馏水浸泡２４ｈ后，切成小碎块，晾干，研磨至粉末；再将药材粉末用提取介质Ⅰ和β－巯基乙醇进行提取，然后再用提取介质Ⅱ和β－巯基乙醇进行提取，产物由氯仿／异戊醇抽提后，水相加入ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）和冰冷的异丙醇使ＤＮＡ沉淀，弃去液相，沉淀用７５％乙醇洗涤２～３次，去乙醇自然风干；用灭菌ｄｄＨ↓［２］Ｏ溶解ＤＮＡ，４℃保存或－２０℃下放置长期保存。经电泳检测，提取的大黄药材ＤＮＡ是完整的基因组ＤＮＡ，纯度较高（Ａ↓［２６０］／Ａ↓［２８０］＝１．８－２．０之间）。所得基因组ＤＮＡ作模板，分别用ＵＢＣ８８８和ＵＢＣ８９１引物对药材基因组ＤＮＡ进行扩增，能得到条带清晰的图谱。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及一种药材DNA提取方法，尤其涉及一种唐 古特大黄药材DNA提取方法。
技术介绍
唐古特大黄，又名鸡爪大黄，隶属于为蓼科(Polygonaceae)大黄属(及/^画 L)，多年生草本植物，分布在西藏东部、青海、甘肃，生于海拔1700-4300 米山坡林缘、灌丛中及半阴坡石堆中，是中国特有种。其干燥根及根茎入药， 性寒，味苦；具有泻热通肠，凉血解毒，逐瘀通经之功效；为《中华人民共和 国药典》(2005)中记载的"正品大黄"之一。随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术已逐渐渗透到中药研究领域。 基因组DNA的提取是DNA分子标记技术研究的一个重要步骤。大黄中药材 中含有较多的蒽醌类、多糖和鞣质类等次生代谢物质，这些次生代谢物质抑制 DNA聚合酶的活性，影响后续DNA的扩增工作。因此，大黄药材DNA的提 取是DNA分子标记技术应用于大黄中药研究的一个关键。从唐古特大黄药材DNA提取方法，主要有CTAB法。由于唐古特大黄中药材中含有较多的次生代谢物质蒽醌类、鞣质、蛋白质及多糖等，这些物质 难以去除，所得DNA沉淀较多，呈黄色至褐色，难以溶解，CTAB法未能成 功提取到基因组DNA。因此，在提取前，必须对唐古特大黄药材进行预处理， 如用(TC95。/。的酒精浸泡，或用(TC提取介质I (200mmol/L Tris-HCl,pH8.0， 50mmol/L EDTA pH8.0,0.25mol/LNaCl)浸泡。但是无论用哪种方法对药材进 行预处理，提取DNA的电泳检测时均有DNA片断，但所提取的DNA都有脱 尾现象，说明降解严重。另外用Beckman coulter DU640紫外分光光度仪对所 得DNA进行纯度检验，在260nm及280nm吸光度(A)的比值(A260/A280) 可作为DNA纯度的指标，测定用0〔95%的酒精浸泡处理的药材，所得DNA 提取液的A26o/A28o在1.65-1.83之间；用0"C提取介质I浸泡处理的药材，所得 DNA提取液的A26o/A28。在1.38-1.57之间，说明所得DNA纯度较低。Komatsu Katsuko(2006)用DNeasyTM Plant Mini Kit(QIAGEN， Germany)试剂盒对不同来源的大黄药材提取其基因组DNA，而试剂盒相对来说，成本 高，价格比较昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成本低，提取工艺简单易行、纯度高的从唐古 特大黄药材提取DNA的方法。本专利技术唐古特大黄药材DNA提取方法，包括以下工艺步骤(1) 药材的预处理将唐古特大黄干药材用0 4'C的蒸馏水浸泡20 48h， 每隔4h更换一次蒸馏水；以除去尽量多的蒽醌类、多糖和鞣质类等次生代谢 物质。然后切成小碎块，凉干备用。提取前用70%乙醇擦洗表面或轻轻刮去表 面的污染物。(2) 将经处理的大黄药材置于研钵中研磨至粉末状；研磨同时加入大黄 药材体积2 3% (w/v)的PVP干粉，目的是有效去除酚类，在研钵中还加入 少许石英砂。(3) 将研磨好的干粉转入离心管中，加入药材粉末体积5~10倍的提取介 质I和药材粉末体积0.5 1%的卩-巯基乙醇，在-l-l(TC提取10 15min，以进 一步去除药材中的次生代谢物质。所述提取介质I是由200mmol/L Tris-HCl(pH8.0)， 50mmol/L EDTA(pH8.0)，0.25mol/LNaCl组成。(4) 于0 4'C， 2000r/min下离心8 10min，收集沉淀；所得沉淀采用步 骤(3)的工艺继续提取。(5) 在收集的沉淀中加入的沉淀体积4~5倍的提取介质II和沉淀体积 0.5~1% 的p-巯基乙醇，在60 65。C下水浴50 60min，不时轻轻摇动；所述 提取介质 II 由 pH8.0 的 100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA,2%(m/V)CTAB,l .4mol/LNaCl混合而成。(6) 冷却至室温，加入反应体系等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管， 抽提后，于0 4-C, 12000r/min，离心8 10min;所述氯仿/异戊醇的体积比为 24:1。(7) 将步骤(4)离心分离的水相转入另一离心管，加入水相体积1/10 的CTAB/NaCl，轻轻混匀，再加入水相等体积的氯仿/异戊醇抽提；抽提产物 采用步骤(6)的工艺继续抽提。所述CTAB/NaCl是由100g/LCTAB， 0.7mol/L NaCl组成；所述氯仿/异戊醇的体积比为24:l。(8) 在抽提后的水相中加入水相体积1/10、浓度为3mol/L的NaAc和水相体积2/3的异丙醇，摇匀后于-20。C放置2h 3h;弃去液相，沉淀用75%乙 醇洗涤2 3次，去乙醇自然风千，得大黄DNA;然后用灭菌ddH20溶解DNA， 于0 4'C保存，或于-2(TC下放置长期保存。 整个提取过程要温和，以防DNA的断裂。本专利技术方法提取的DNA，在电泳检测时，在23kb处有一条清晰的DNA 条带，说明所提取的基因组DNA是完整的基因组DNA。另外，用Beckman coulter DU640紫外分光光度仪对本专利技术所得DNA进 行纯度检验，发现在260證及280nm吸光度(A)的比值(A26。/A280)， A260/A280=l.8-2.0之间(比值A260/A280可作为DNA纯度的指标，A260/A280=l.8-2.0 之间，意指高纯度的DNA)，说明所得DNA纯度较高。以本专利技术法所得基因组DNA作模板，分别用UBC888和UBC891引物对 药材基因组DNA进行扩增，能得到条带清晰的图谱。本专利技术不用试剂盒就能从大黄药材中提取到高质量的基因组DNA，成本 低，工艺简单，操作方便。附图说明图1为采用不同方法从唐古特大黄药材中所提基因组DNA电泳检测图 其中l-2: (TC提取介质I处理药材 3-4: (TC95。/。酒精处理药材 5-6:本专利技术方法提取 7-8:高盐低pH法 9-10:对药材不作预处理 M:入DNA/历"週marker图2为引物UBC891对唐古特大黄药材PCR扩增结果 其中1-2为两个重复，M为200bp marker具体实施例方式1、唐古特大黄药材DNA的提取 (1)将野外采集唐古特大黄根，每3cm切成一段，用线穿起自然晾干备用。取2g唐古特大黄药材用300ml (TC蒸馏水水浸，每隔4h更换一次蒸馏水， 浸泡24h;然后切成小碎块，凉干备用。用前用70%乙醇擦洗表面或轻轻刮去表面的污染物。(2) 取O.lg预处理的唐古特大黄药材置于加有少许石英砂的研钵中研磨 至粉末状，研磨的同时加入少许PVP干粉。(3) 将研磨好的干粉转入2ml离心管，加入lml冰冷的提取介质I (200mmol/L Tris-HCl， pH8.0， 50mmol/L EDTA pH8.0， 0.25mol/L NaCl的混合液)和10pl(3-巯基乙醇在0。C放置10min。在4。C下2 000r/min离心10min， 收集沉淀，再用提取介质I提取，离心，收集沉淀，合并两次提取的沉淀。(4) 在所得沉淀中加入900W 65"C预热的提取介质II (10Ommol/L Tri本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种唐古特大黄药材ＤＮＡ提取方法，包括以下工艺步骤：　（１）药材的预处理：将唐古特大黄干药材用０～４℃的蒸馏水浸泡２０～４８ｈ，然后切成小碎块，凉干备用；　（２）将经处理的大黄药材置于研钵中研磨至粉末状；　（３）将研磨好的干粉转入离心管中，加入药材粉末体积５～１０倍提取介质Ⅰ和药材粉末体积０．５～１％的β－巯基乙醇，于－１～１０℃提取１０～１５ｍｉｎ；所述提取介质Ⅰ由２００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．２５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ组成；　（４）于０～４℃，２０００ｒ／ｍｉｎ下离心８～１０ｍｉｎ，收集沉淀；　（５）在离心分离的沉淀中加入的沉淀体积４～５倍的提取介质Ⅱ和沉淀体积０．５～１％的β－巯基乙醇，在６０～６５℃下水浴５０～６０ｍｉｎ；所述提取介质Ⅱ由ｐＨ８．０的１００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，２％（ｍ／Ｖ）ＣＴＡＢ，１．４ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ混合而成；　（６）冷却至室温，加入反应体系等体积的氯仿／异戊醇抽提后，于０～４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ，离心８～１０ｍｉｎ；所述氯仿／异戊醇的体积比为２４∶１；　（７）将步骤（４）离心分离的水相转入另一离心管，加入水相体积１／１０的ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ，轻轻混匀，再加入水相等体积的氯仿／异戊醇抽提；所述ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ是由１００ｇ／Ｌ　ＣＴＡＢ，０．７ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ组成；所述氯仿／异戊醇的体积比为２４∶１；　（８）在抽提后的水相中加入水相体积１／１０、浓度为３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＡｃ和水相体积２／３的异丙醇，摇匀后于－２０℃放置２ｈ～３ｈ；弃去液相，沉淀用７５％乙醇洗涤２～３次，去乙醇自然风干，得大黄ＤＮＡ；然后用灭菌ｄｄＨ↓［２］Ｏ溶解ＤＮＡ，于０～４℃保存，或于－２０℃下放置长期保存。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李毅，胡延萍，王莉，杨建，谢小龙，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：63[中国|青海]