一种奥曲肽工业化生产的合成方法，其特征在于：依次包括以下步骤：第一步，以氨甲基树脂为起始树脂，将原料Fmoc‑Thr‑x利用缩合试剂HOBT与DIC偶联到树脂上，生成Fmoc‑Thr‑x AM Resin；然后按照顺序依次将氨基酸Cys、Thr、Lys、Trp、Phe、Cys、Phe逐个偶联到Fmoc‑Thr‑x AM Resin上，得到奥曲肽肽树脂；第二步，加入裂解液，搅拌均匀裂解2~3h；第三步，将奥曲肽粗肽溶解到TFA/水混合溶液中，然后放入35℃~38℃的水浴中加热2~3h，使得奥曲肽的线性肽在HPLC图谱中的峰型单一；第四步，加入DMSO后氧化1~1.5h，HPLC检测环化终点，纯化分离得到奥曲肽精制品。总之，本发明专利技术的合成方法工艺简单，适合工业化生产，奥曲肽粗肽经过后处理后的HPLC峰型比较单一，环化方法易于操作，环化彻底，收率高，纯度为98%以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于奥曲肽合成领域，具体涉及一种奥曲肽工业化生产的合成方法。
技术介绍
醋酸奥曲肽的肽序如下：D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OL（Disulfidebridgecys2-cys7）主要包含7个常规氨基酸和一个苏氨醇。奥曲肽为一种人工合成的八肽环状化合物，具有与天然内源性生长抑素类似的作用，但作用较强且持久，半衰期较天然抑素长30倍。奥曲肽有多种生理活性，如抑制生长激素、促甲状腺素、胃肠道和胰内分泌激素的病理性分泌过多，对胃酸、胰酶、胰高血糖素和胰岛素的分泌也有抑制作用。临床主要用于以下几个方面：门脉高压引起的食管静脉曲张出血，应激性溃疡及消化道出血，重型胰腺炎，缓解由胃、肠及胰内分泌系统肿瘤所引起的症状，突眼性甲状腺肿和肢端肥大症，胃肠道瘘管。奥曲肽的相关专利主要涉及的是合成及环化方法的优化。其中，中国专利CN1569890A中涉及到的合成方法太过繁琐，首先合成原料Fmoc-Thr-ol然后在将氨基树脂、缩醛化产物、DCC、HOBT按照一定的比例溶于NMP中于固相反应器中搅拌反应，然后洗涤脱掉保护，再通气充分搅拌6~10h。这种合成方法存在着一些缺点：第一，在反应过程中没有专业的测替代度的仪器跟踪，替代度不好控制；第二，反应时间较长对大生产来说风险更大。专利公开号为CN1837232A中主要涉及到的是醋酸奥曲肽的一对二硫键的环化方法，通过称取粗肽加入5%的乙酸铵水溶液将pH调至中性，放置空气中两天左右让其自然氧化，虽然这个氧化方法可行但是长时间的实验证明，第一，氧化时间较长目的肽生成的同时杂质也一并的在增大增多，给纯化带来较大的麻烦；第二，氧化时间虽然较长但是检测发现还是有部分奥曲肽粗品未氧化完全，这无疑大大的降低了生产收率是一个很大的缺陷。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种奥曲肽工业化生产的合成方法，解决了上述现有技术中存在的合成工艺不适合大规模工业化生产、奥曲肽成品纯度不高、收率不高的问题。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种奥曲肽工业化生产的合成方法，依次包括以下步骤：第一步，以氨甲基树脂为起始树脂，将原料Fmoc-Thr-x利用缩合试剂HOBT与DIC偶联到树脂上，生成Fmoc-Thr-x-AMResin，其中，所述氨甲基树脂的替代度为0.55~0.65mmol/g，投入的所述Fmoc-Thr-x、HOBT以及DIC的摩尔量均为所需合成的奥曲肽的摩尔量的2~3倍；然后按照顺序依次将氨基酸Cys、Thr、Lys、D-Trp、Phe、Cys、D-Phe逐个偶联到Fmoc-Thr-x-AMResin上，得到奥曲肽肽树脂；所述Fmoc-Thr-x的化学结构式为；第二步，向所述奥曲肽肽树脂中加入裂解液，搅拌均匀裂解2~3h，其中，奥曲肽肽树脂与裂解液的配比为向每1g奥曲肽肽树脂中加入10ml裂解液；裂解完成后，过滤，将滤液缓慢加入预先冰冻的无水乙醚中沉降20~40min后离心得到奥曲肽线性粗肽；第三步，将所述奥曲肽线性粗肽溶解到TFA/水混合溶液中，然后放入35℃~38℃的水浴或加热套中加热2~3h，使得奥曲肽线性粗肽在HPLC图谱中的峰型单一，其中，所述奥曲肽线性粗肽与TFA/水混合溶液的配比为向每1g奥曲肽线性粗肽中加入300ml的TFA/水混合溶液，TFA/水混合溶液中TFA的体积百分含量为5‰；第四步，向所述第三步加热后的溶解有奥曲肽线性粗肽的TFA/水混合溶液中加入DMSO后氧化1~1.5h，加入的DMSO的体积占溶解有奥曲肽线性粗肽的TFA/水混合溶液的总体积5~8%，然后，HPLC检测环化终点，纯化分离得到奥曲肽精制品。上述技术方案中的有关内容解释如下：1、上述方案中，较佳的方案是在所述第二步中，所述裂解液是由TFA、苯甲硫醚、EDT以及苯甲醚组成的混合溶液，TFA、苯甲硫醚、EDT以及苯甲醚的体积比为90:5:3:2。2、上述方案中，较佳的方案是在所述第二步中，所述滤液与无水乙醚的体积比为1:8。3、上述方案中，出现的缩写具有的含义为：AMResin：氨甲基树脂；Fmoc-Thr-x：芴甲氧羰基苏氨醇对羧基苯缩醛，其化学结构式为；HOBT：1-羟基苯并三唑；DIC：N,N'-二异丙基碳二亚胺；Cys：半胱氨酸；Thr：苏氨酸；Lys：赖氨酸；D-Trp：D型色氨酸；Phe：苯丙氨酸；D-Phe:D型苯丙氨酸TFA：三氟乙酸；EDT：1,2-乙二硫醇；DMSO：二甲基亚砜；DCM：二氯甲烷DMF：N,N-二甲基甲酰胺。4、上述方案中，固相合成中树脂一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，立体上是一个空间网状结构，反应物分子可以在在树脂内部自由移动，树脂中最关键的部分是连接手臂，它的一端连接在树脂上，一端作为反应位点，其反应位点我们一般用替代度（sub）单位为mmol/g来表示。本专利技术的各步骤反应式：（1）偶联Fmoc-Thr-x，（2）偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH，（重复以上步骤偶联至最后一个氨基酸）（3）一次偶联剩下氨基酸得到肽树脂，D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-x-AMResin（4）将肽从肽树脂上裂解得到奥曲肽粗肽，（5）氧化，。本专利技术的设计特点为：（1）在本专利技术技术方案的所述第一步中，直结购买需要的AMResin，该步骤反应条件温和，避免了起始树脂制备的苛刻反应条件；（2）在本专利技术技术方案的所述第三步中，将奥曲肽粗肽溶解到TFA/水混合溶液中再放入水浴加热一段时间，目的是使得奥曲肽的线性肽在HPLC图谱中的峰型单一，这是因为奥曲肽的肽序中含有色氨酸（D-Trp），在反应过程中色氨酸上的吲哚基会取代甲酸形成分子量比奥曲肽分子量大44的一种副产物，该副产物在HPLC（高效液相）上可以检测出峰，利用本专利技术中的方法可以将这个峰还原成目的奥曲肽的峰，这样就提高了奥曲肽的收率，纯度更高，能够减少后续纯化次数，以便节省费用利于放大生产；如果不进行本专利技术的还原步骤的话，在后续纯化过程中将这个副产物的峰型当成杂质除掉，则会大大降低奥曲肽的收率。（3）在本专利技术技术方案的所述第四步中，用DMSO环化奥曲肽的线性肽，反应时间在1~1.5h，并且该步骤反应可在较大pH值（2~8）范围内进行，对于碱性或是疏水性较强的肽尤其适合，对D-Trp无影响，避免了以往在碘/甲醇溶液中线性肽环化速度较快，反应较剧烈容易产生较多杂质的弊端，也避免了空气氧化反应时间长、环化不完全的问题，还避免了使用双氧水环化时需调溶液pH值等一系列的问题。总之，本专利技术的合成方法工艺简单，适合工业化大生产，奥曲肽粗肽经过后处理后的HPLC峰型比较单一，其中的环化方法易于操作，环化彻底，收率高，收率由原来的采用双氧水环化方法的45%提高到了58%以上，奥曲肽精制品的纯度为98%以上。附图说明附图1为实施例1的奥曲肽水浴前线性肽的HPLC图谱；附图2为实施例1的奥曲肽水浴后线性肽的HPLC图谱；附图3为实施例1的奥曲肽环化粗品的HPLC图谱；附图4为实施例1的奥曲肽精制品的HPLC图谱。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述：以下各实施例和对照例使用的试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种奥曲肽工业化生产的合成方法，其特征在于：该合成方法依次包括以下步骤：第一步，以氨甲基树脂为起始树脂，将原料Fmoc‑Thr‑x利用缩合试剂HOBT与DIC偶联到树脂上，生成Fmoc‑Thr‑x‑ AM Resin，其中，所述氨甲基树脂的替代度为0.55~0.65 mmol/g，投入的所述Fmoc‑Thr‑x、HOBT以及DIC的摩尔量均为所需合成的奥曲肽的摩尔量的2~3倍；然后按照顺序依次将氨基酸Cys、Thr、Lys、D‑Trp、Phe、Cys、D‑Phe逐个偶联到Fmoc‑Thr‑x‑ AM Resin上，得到奥曲肽肽树脂；所述Fmoc‑Thr‑x的化学结构式为；第二步，向所述奥曲肽肽树脂中加入裂解液，搅拌均匀裂解2~3h，其中，奥曲肽肽树脂与裂解液的配比为向每1g奥曲肽肽树脂中加入10ml裂解液；裂解完成后，过滤，将滤液缓慢加入预先冰冻的无水乙醚中沉降20~40min后离心得到奥曲肽线性粗肽；第三步，将所述奥曲肽线性粗肽溶解到TFA/水混合溶液中，然后放入35℃~38℃的水浴或加热套中加热2~3h，使得奥曲肽线性粗肽在HPLC图谱中的峰型单一，其中，所述奥曲肽线性粗肽与TFA/水混合溶液的配比为向每1g奥曲肽线性粗肽中加入300ml的TFA/水混合溶液，TFA/水混合溶液中TFA的体积百分含量为5‰；第四步，向所述第三步加热后的溶解有奥曲肽线性粗肽的TFA/水混合溶液中加入DMSO后氧化1~1.5h，加入的DMSO的体积占溶解有奥曲肽线性粗肽的TFA/水混合溶液的总体积5~8%，然后，HPLC检测环化终点，纯化分离得到奥曲肽精制品。...
【技术特征摘要】
1.一种奥曲肽工业化生产的合成方法，其特征在于：该合成方法依次包括以下步骤：第一步，以氨甲基树脂为起始树脂，将原料Fmoc-Thr-x利用缩合试剂HOBT与DIC偶联到树脂上，生成Fmoc-Thr-x-AMResin，其中，所述氨甲基树脂的替代度为0.55~0.65mmol/g，投入的所述Fmoc-Thr-x、HOBT以及DIC的摩尔量均为所需合成的奥曲肽的摩尔量的2~3倍；然后按照顺序依次将氨基酸Cys、Thr、Lys、D-Trp、Phe、Cys、D-Phe逐个偶联到Fmoc-Thr-x-AMResin上，得到奥曲肽肽树脂；所述Fmoc-Thr-x的化学结构式为；第二步，向所述奥曲肽肽树脂中加入裂解液，搅拌均匀裂解2~3h，其中，奥曲肽肽树脂与裂解液的配比为向每1g奥曲肽肽树脂中加入10ml裂解液；裂解完成后，过滤，将滤液缓慢加入预先冰冻的无水乙醚中沉降20~40min后离心得到奥曲肽线性粗肽；第三步，将所述奥曲肽线性粗肽溶解到TFA...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏丹，王良友，陈逸民，黄保胜，徐瑞，
申请(专利权)人：苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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