本发明专利技术公开了一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽。本发明专利技术以双髻鲨鱼肉为原料，通过双酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)，ESI-MS测定分子量为610.77 Da；制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时亦可促进Nrf2蛋白质积累，激活Nrf2-ARE通路，可用作治疗肝损伤、皮肤光老化、动脉硬化、中风、糖尿病和肥胖等与Nrf2-ARE通路密切相关疾病治疗的药物和功能产品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗氧化活性肽，具体涉及一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽。
技术介绍
鲨鱼全身是宝，有的种类肉质鲜美，是餐桌上常见的菜肴。鱼皮具有良好的韧性，是皮革加工业的原料。现代医学证明鲨鱼软骨也具有很大的药用价值，1992年美国首先将鲨鱼软骨粉直接用于临床治疗肿瘤。双髻鲨（Sphyrnalewini）为软骨鱼纲，真鲨目，双髻鲨科，在我国主要分布于黄海、东海和南海。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽。本专利技术为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种具有激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽，该抗氧化肽为六肽化合物，氨基酸序列为Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)，ESI-MS测定分子量为610.77Da。该双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法为：1）双髻鲨鱼肉的预处理：取双髻鲨鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至90~95℃后保温5~10min，然后按照料液比1g:2~4mL加入异丙醇，于25～30℃、功率450～500W超声提取2～3h，然后于4℃、9000~10000rpm离心10~15min除去异丙醇，收集脱脂双髻鲨鱼肉固形物；2）脱脂双髻鲨鱼肉固形物的酶解：取脱脂双髻鲨鱼肉固形物，按固液比1g:10mL～15mL加入甘氨酸—氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L，pH9.5），用0.1mol/LHCl或0.1mol/LNaOH调节pH到9.0～10.0，得混合液；将混合物温度调制55～65℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.2%～1.5%加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.95×105U/g），酶解时间2h～2.5h后，酶解液于90～95℃保温10～15min，灭酶活；将酶解液温度调至35~45℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.0%～1.2%加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104U/g），酶解时间3h～4h，酶解液于90～95℃保温10～15min后降至室温，于10000～12000rpm离心10～15min，取上清液。）双髻鲨鱼肉抗氧化肽的分离制备：将上述上清液依次经超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化，得双髻鲨鱼肉抗氧化肽。作为优选，所述步骤3）的超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：超滤：将上述酶解上清液采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，得超滤酶解液。大孔树脂精制：将超滤酶解液配成15～20mg/mL的溶液，缓慢加入到超滤酶解液与D101大孔树脂比为1:10～15的玻璃柱中，用3～5倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用3～4倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为大孔树脂精制多肽。凝胶柱层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20～30mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexG-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于220nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对羟基自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)，ESI-MS测定分子量为610.77Da。再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15～20μL；色谱柱ZorbaxSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：水-乙腈梯度洗脱（0～45min乙腈浓度由0匀速升至45%）；洗脱速度0.8~1.0mL/min；紫外检测波长220nm。本专利技术所提供的一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽，Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)还可促进Nrf2蛋白质积累，激活Nrf2-ARE通路，进而上调抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保护机体免受毒物的损伤。因此，Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)可用作治疗肝损伤、皮肤光老化、动脉硬化、中风、糖尿病和肥胖等与Nrf2-ARE通路密切相关疾病治疗的药物或功能产品。附图说明图1是本专利技术的葡聚糖凝胶SephadexG-25层析图。图2葡聚糖凝胶SephadexG-25制备酶解物的RP-HPLC色谱图。图3Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)对Nrf2蛋白质水平的影响。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例：双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下：双髻鲨鱼肉\双酶酶解\酶解物\超滤\大孔树脂纯化\凝胶过滤层析\高效液相色谱制备\抗氧化肽。）双髻鲨鱼肉的预处理：取双髻鲨鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至95℃后保温8min，然后按照料液比1g:3mL加入异丙醇，于25℃、功率500W超声提取3h，然后于4℃、10000rpm离心10min除去异丙醇，收集脱脂双髻鲨鱼肉固形物；2）脱脂双髻鲨鱼肉固形物的酶解：取脱脂双髻鲨鱼肉固形物，按固液比1g:12mL加入甘氨酸—氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L，pH9.5），用0.1mol/LHCl或0.1mol/LNaOH调节pH到9.5，得混合液；将混合物温度调制60℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.2%加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.95×105U/g），酶解时间2.5h后，酶解液于95℃保温15min，灭酶活；将酶解液温度调至40℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.0%加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104U/g），酶解时间34h，酶解液于95℃保温15min后降至室温，于12000rpm离心10min，取上清液。）双髻鲨鱼肉抗氧化肽的分离制备：将上述上清液依次经超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化，得双髻鲨鱼肉抗氧化肽。①超滤：将上述酶解上清液采用采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，得超滤酶解液。②大孔树脂精制：将超滤酶解液配成20mg/mL的溶液，缓慢加入到滤酶解液与D101大孔树脂重量体积比（mg/mL）为1:15的玻璃柱中，用3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用4倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为大孔树脂精制多肽。③凝胶柱层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为25mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexG-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为1.0mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于220nm检测，按峰合并试管内溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种激活Nrf2‑ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽为四肽化合物，氨基酸序列为Ile‑Ile‑Gly‑Leu‑Val‑Pro ，ESI‑MS测定分子量为610.77 Da。
【技术特征摘要】
1.一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽为四肽化合物，氨基酸序列为I...
【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，赵玉勤，孙坤来，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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