发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的方法技术

发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的方法，该方法步骤依次包括菌种固体培养、发酵培养、发酵液提取和纯化。本发明专利技术选用直接葡萄糖发酵法工业化生产L-羟脯氨酸，提高了L-羟脯氨酸的发酵单位、收率和质量，降低了生产成本，避免了三废污染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及发酵工程，具体涉及微生物直接利用葡萄糖发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的方法。
技术介绍
羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸羟基化后的产物，其分子式为C5H9NO3。羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274℃，易溶于水，微溶于乙醇。自然界中反式-4-羟基脯氨酸较为常见，反式-4-羟脯氨酸最早发现于动物胶原蛋白中。反式-4-羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。目前，国内外报道的生产羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工业生产方法。但是，蛋白水解提取法需经过强酸强碱处理，纯化步骤长，而且羟脯氨酸提取率在4％-7％，提取和原料成本高，不仅浪费大量原料，而且废弃物污染严重，随着目前环境压力的增加和资源原料价格的上升，传统的蛋白水解提取法正逐渐被市场淘汰。微生物发酵法正以其绿色环保的工艺、原料和成本低廉的优势迅速发展起来。目前，微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的研究还处于实验室阶段，尚未形成成熟的工业化生产工艺，而先进的工业化生产工艺，尤其是菌种的固体培养及液体发酵培养方法、发酵液的提取方法、浓缩液的纯化方法对于L-羟脯氨酸的发酵单位、收率、质量、成本和三废排放有着至关重要的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的方法，采用该方法工业化生产L-羟脯氨酸，有利于提高L-羟脯氨酸的发酵单位、收率、质量，降低生产成本，避免三废污染。本专利技术的技术解决方案为：发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的方法，步骤包括菌种固体培养、发酵培养、发酵液提取和纯化：(1)菌种固体培养：菌种固体培养基用2N的NaOH溶液调pH到7.0，分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121℃灭菌15分钟，取出冷却到50～60℃后，于无菌室中加入10％的AMP溶液，到AMP终浓度为50ppm，摇匀后倾斜30°放置，待凝固后置无菌室备用；在超净工作台用接种环划一环菌种均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37±1.0℃的培养箱中培养24～48小时，菌苔长好后直接上罐或放置0～5℃冰箱中备用；其中菌种来源于中科院天津工业生物技术研究所，菌株是一株EscherichiaColiK12W3110变种；菌种固体培养基由酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、AMP组成，其配方为酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L、AMP50mg/L；其中浓度为10％的AMP溶液由氨苄西林溶解于蒸馏水中制得；(2)发酵培养：首先是菌种在液体种子培养基中培养得到成熟的种子，然后移入发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸；其中液体种子培养基水溶液配方(g/L)为：葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸铵2.0、磷酸二氢钾7.5、氯化钾1.9、FeSO4·7H2O0.28、MgSO4·7H2O0.32、微量元素(ppm)：MnSO4·H2O0.5、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.2、CuSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.6、VB120、消泡剂100、AMP50，其中发酵培养基配方(g/L)如下：葡萄糖20、酵母粉5.0、硫酸铵10、磷酸二氢钾5.0、氯化钾1.9、MgSO4·7H2O0.32、FeSO4·7H2O0.75、微量元素(ppm)：MnSO4·H2O1.0、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.4、CuSO4·7H2O1.0、ZnSO4·7H2O1.2、消泡剂200、AMP50；其中成熟种子的培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15-0.20MPa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入种子罐，4T种子罐配2.4T液体种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接蒸汽加热到121℃，0.1MPa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36℃，pH7.0～9.0，压力0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，将内含由固体培养菌种培养收集得来的菌液的接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压0.05～0.1MPa，接种量1瓶，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03MPa、风量0.2～1.2VVM、pH6.5、搅拌转速200～600rpm、溶氧20％以上、培养时间8～24小时、OD600达到10～20、最终葡萄糖含量小于10g/L；其中发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15-0.17MPa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95～105℃，直接蒸汽加热到121℃，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35℃，调pH到6.5，备接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度35℃，罐压0.03MPa，风量0.5～1.2VVM，pH6.5，搅拌转速60～300rpm，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在30～90g/L、糖浓度≦2.0％；⑤发酵结束后，发酵液加热至80℃，立即降温至40℃，用压缩空气压至发酵液贮罐；(3)发酵液提取：依次包括以下步骤：首先发酵液微滤，储罐中的发酵液用泵打入加热罐中，加热并保温40±5℃，开启膜过滤器对发酵液进行过滤，微滤温度35～45℃，微滤压力0.30Ma，微滤流速80～100L/m2/h，膜孔径0.05～1.0um，膜厚度10～150um；然后，微滤后的滤液进一步超滤，超滤温度40～50℃，超滤压力1.0MPa，超滤流速30～35L/m2/h，膜孔径0.015～0.1um，膜厚度150～250um，非对称性膜；最后，超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液，纳滤温度45～55℃，纳滤压力0.5～3.5MPa，纳滤流速2.5～4.5L/m2/h，膜孔径1～5nm，膜厚度100～300um，非对称性膜；(4)纯化：依次包括粗结晶和精制过程，其中，粗结晶过程为：①将浓缩液打入结晶罐中，迅速搅拌降温至0～10℃，5±3℃静止结晶4小时；②将粗品离心甩干，冰水淋洗，60℃热循环干燥箱干燥6小时，控制水份≦5％，即得粗品；精制过程为：①在搅拌下将本文档来自技高网...

【技术保护点】
发酵法工业化生产L‑羟脯氨酸的方法，其特征在于，步骤包括菌种固体培养、发酵培养、发酵液提取和纯化：(1)菌种固体培养：菌种固体培养基用2N的NaOH溶液调pH到7.0，分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121℃灭菌15分钟，取出冷却到50～60℃后，于无菌室中加入10％的AMP溶液，到AMP终浓度为50ppm，摇匀后倾斜30°放置，待凝固后置无菌室备用；在超净工作台用接种环划一环菌种均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37±1.0℃的培养箱中培养24～48小时，菌苔长好后直接上罐或放置0～5℃冰箱中备用；(2)发酵培养：首先是菌种在液体种子培养基中培养得到成熟的种子，然后移入发酵培养基中发酵代谢产生L‑羟脯氨酸；成熟种子的培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15‑0.20MPa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入种子罐，4T种子罐配2.4T液体种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接蒸汽加热到121℃，0.1MPa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36℃，pH7.0～9.0，压力0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，将内含由固体培养菌种培养收集得来的菌液的接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压0.05～0.1MPa，接种量1瓶，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03MPa、风量0.2～1.2VVM、pH6.5、搅拌转速200～600rpm、溶氧20％以上、培养时间8～24小时、OD600达到10～20、最终葡萄糖含量小于10g/L；发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15‑0.17MPa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95～105℃，直接蒸汽加热到121℃，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35℃，调pH到6.5，备接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度35℃，罐压0.03MPa，风量0.5～1.2VVM，pH6.5，搅拌转速60～300rpm，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在30～90g/L、糖浓度≦2.0％；⑤发酵结束后，发酵液加热至80℃，立即降温至40℃，用压缩空气压至发酵液贮罐；(3)发酵液提取：依次包括以下步骤：首先发酵液微滤，储罐中的发酵液用泵打入加热罐中，加热并保温40±5℃，开启膜过滤器对发酵液进行过滤，微滤温度35～45℃，微滤压力0.30Ma，微滤流速80～100L/m2/h，膜孔径0.05～1.0um，膜厚度10～150um；然后，微滤后的滤液进一步超滤，超滤温度40～50℃，超滤压力1.0MPa，超滤流速30～35L/m2/h，膜孔径0.015～0.1um，膜厚度150～250um，非对称性膜；最后，超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液，纳滤温度45～55℃，纳滤压力0.5～3.5MPa，纳滤流速2.5～4.5L/m2/h，膜孔径1～5nm，膜厚度100～300um，非对称性膜；(4)纯化：依次包括粗结晶和精制过程，其中，粗结晶过程为：①将浓缩液打入结晶罐中，迅速搅拌降温至0～10℃，5±3℃静止结晶4小时；②将粗品离心甩干，冰水淋洗，60℃热循环干燥箱干燥6小时，控制水份≦5％，即得粗品；精制过程为：①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃纯水中，升温至75℃完全溶解；②按粗品重量的10％加入769活性碳，在75℃脱色15分钟，过滤；③脱色液经冷盘管降温至0～10℃，按体积比15％加入浓度80％的工业醋酸，搅拌有大量晶体析出后停搅拌，5±3℃保温结晶4小时，结晶结束时母液浓度2～3g/L；④将结晶液转入离心机离心，冰水淋洗，湿粉进双锥干燥器80℃真空干燥4～6小时得L‑羟脯氨酸精品。...

【技术特征摘要】
1.发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的方法，其特征在于，步骤包括菌种固体培养、
发酵培养、发酵液提取和纯化：
(1)菌种固体培养：菌种固体培养基用2N的NaOH溶液调pH到7.0，分装于10ml
斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121℃灭菌15分钟，取出冷却到50～60℃后，
于无菌室中加入10％的AMP溶液，到AMP终浓度为50ppm，摇匀后倾斜30°放置，
待凝固后置无菌室备用；在超净工作台用接种环划一环菌种均匀涂布在试管或茄子瓶空
白斜面上，放置37±1.0℃的培养箱中培养24～48小时，菌苔长好后直接上罐或放置0～5℃
冰箱中备用；
(2)发酵培养：首先是菌种在液体种子培养基中培养得到成熟的种子，然后移入
发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸；成熟种子的培养包括以下步骤：①空罐灭菌：
0.15-0.20MPa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入种子罐，4T种子罐配2.4T
液体种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接蒸汽加热到121℃，0.1MPa
压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃待接种；④接种：采用压差法将
菌液接入罐内，接种温度36℃，pH7.0～9.0，压力0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过
95％乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，将内含由固体培养菌种培养收集得来的菌
液的接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入
接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压0.05～0.1MPa，接种量1瓶，接种结束后，用浸过
75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤
培养：培养温度36℃、罐压0.03MPa、风量0.2～1.2VVM、pH6.5、搅拌转速200～600rpm、
溶氧20％以上、培养时间8～24小时、OD600达到10～20、最终葡萄糖含量小于10g/L；发
酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15-0.17MPa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐
灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95～105℃，直
接蒸汽加热到121℃，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35℃，调pH到6.5，备接
种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度35℃，罐压0.03MPa，
风量0.5～1.2VVM，pH6.5，搅拌转速60～300rpm，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在
30～90g/L、糖浓度≦2.0％；⑤发酵结束后，发酵液加热至80℃，立即降温至40℃，用压
缩空气压至发酵液贮罐；
(3)发酵液提取：依次包括以下步骤：首先发酵液微滤，储罐中的发酵液用泵
打入加热罐中，加热并保温40±5℃，开启膜过滤器对发酵液进行过滤，微滤温度35～45℃，

\t微滤压力0.30Ma，微滤流速80～100L/m2/h，膜孔径0.05～1.0um，膜厚度10～150um；然
后，微滤后的滤液进一步超滤，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵体金，林俊辉，彭久合，
申请(专利权)人：天津市敬业精细化工有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12