本发明专利技术揭示了一种检测HER‑2基因扩增的试剂盒及检测方法，包括PCR反应液，dNTPs混合液，阳性对照品，阴性对照品和包装物，所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液，HER‑2基因特异性上游引物，HER‑2基因特异性上游引物，RPPH基因特异性上游引物，RPPH基因特异性下游引物，DNA聚合酶及饱和染料；通过本发明专利技术的试剂盒检测HER‑2基因扩增，利用PCR熔解曲线法及数据处理软件将检测的数据直观准确的表达，本发明专利技术具有快速、简便、有效地检测HER‑2基因的扩增，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，有效提高了检测效率与检测通量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分子生物学领域，尤其是涉及一种PCR方法检测HER-2基因扩增的试剂盒及方法。
技术介绍
在我国，乳腺癌是女性最常见的肿瘤，其发病率约占全部女性恶性肿瘤的15％，死亡率约占全部女性恶性肿瘤的6.9％，并呈不断上升的趋势(WanqingChen，RongshouZheng，PeterD.Baade，etal.CancerStatisticsinChina，2015[J].CaCancerJCLIN，2016，66(2))，多项研究发现，约有20％～30％的乳腺癌患者为人类表皮生长因子受体-2(Her-2/neu)阳性乳腺癌。与西方国家不同的是，我国乳腺癌患者发病年龄日趋年轻化，约有40％的患者在40～49岁被诊断为乳腺癌，一项中国癌症基金会发起的“中国乳腺癌流行病学调研项目”发布的结果显示，我国乳腺癌发病中位年龄为48岁，因此对于乳腺癌的早期诊疗研究对于我国格外具有重要意义。2013年美国临床肿瘤学会(ASCO)发布HER-2基因作为乳腺癌治疗指标的更新建议(JournalofClinicalOncology，2013，31(31)：3997-4013)，次年，中国《乳腺癌HER-2检测指南(2014版)》编写组更新了中国的《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》，更新的指南指出，所有乳腺原发性浸润癌都应进行HER-2检测。只要能获取肿瘤组织，对复发灶或转移灶也应该进行HER-2检测。如HER-2检测结果为不确定，则应使用另一种检测方法进行检测，或对该患者的其他样本进行检测。临床上(UmaKrishnamurti，JanF.Silverman.Her2inBreastCancer：aReviewandUpdate[J].AdvancesinAnatomicPathology，2014，21(2)：100-107)，HER-2基因扩增的乳腺癌患者往往表现出生存率低、肿瘤恶性程度增强、进展迅速、易于发生淋巴结转移、化疗缓解期缩短，并对他莫昔芬(Tamoxifen)和很多细胞毒性化疗药耐药等，但对大剂量蒽环类、紫杉类药物疗效好。1998年美国FDA批准了生物靶向治疗药物曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名：赫赛汀(Herceptin))上市，2002年中国国家食品药品监督总局也批准了该药物在中国上市，赫赛汀的上市在肿瘤治疗史上是具有里程碑意义的事件，是人类历史上第一个人工合成的生物基因靶向治疗药物，使乳腺癌治疗进入了靶向药物治疗时代。目前许多研究表明，赫赛汀(曲妥珠单抗)能够靶向作用于HER-2基因扩增的患者，研究发现，HER-2阳性患者在化疗时家用曲妥珠单抗，可以降低乳腺癌患者的复发风险和病死率，延长患者生存期(VianiGustavoA，AfonsoSergio1，StefanoEduardoJ，etal.AdjuvantTrastuzumabintheTreatmentofHer-2-positiveEarlyBreastCancer：aMeta-analysisofPublishedRandomizedTrials.[J].BmcCancer，2007，7：153)。目前检测方法中，免疫组织化学法检测HER-2蛋白表达是目前最常用的办法，它采用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对想要抗原进行定性、定位、定量检测的一项技术，其主要优点在于操作简便、价格低廉、判读方便、便于保存等，但是检测的过程缺乏标准化，结果易受组织处理、不同抗体的敏感性差异及观察者主观判断的不同等造成检测结果的差异。现有的另一种方法，荧光原位杂交法则通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，利用荧光检测体系对待测DNA进行定性、定量及相对定位分析，其主要优点在于检测冷冻组织或福尔马林固定、石蜡包埋组织的HER-2基因扩增的稳定性较好，不受组织处理等的影响。但是检测费用昂贵，荧光淬灭而致结果无法长期保存，操作难度大、时间长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测HER-2基因扩增的试剂盒及方法来快速、简便、有效地检测HER-2基因的扩增。为实现上述目的，本专利技术提出如下技术方案：一种检测HER-2基因扩增的试剂盒包括PCR反应液，dNTPs混合液，阳性对照品，阴性对照品和包装物，所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液，HER-2基因特异性上游引物，HER-2基因特异性上游引物，RPPH基因特异性上游引物，RPPH基因特异性下游引物，DNA聚合酶及饱和染料；所述HER-2基因特异性上游引物F序列为：CTTAGCTGTCCTGTACACCA，所述HER-2基因特异性下游引物R序列为：CCATATTCTGTGCTGGACGT，所述RPPH基因特异性上游引物F序列为：GCAGGAGATGCCGTGGAC，所述RPPH基因特异性下游引物R序列为：GGGTACCTCACCTCAGCCAT。优选地，所述PCR反应缓冲液包括40mM～60mMTris、1mM～3mMMgCl2、400mg～600mg/LBSA。优选地，所述PCR反应缓冲液包括50mMTris、2mMMgCl2、500mg/LBSA。优选地，所述dNTPs混合液包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。优选地，DNA聚合酶采用热启动Taq酶，每反应用量为0.05U～0.1U。优选地，所述试剂盒包括1管PCR反应液，每管300μl；1管dNTPs混合液，每管40μl；1管阳性对照品，每管40μl和1管阴性对照品，每管40μl。本专利技术的检测HER-2基因扩增的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1)制备试剂盒，包括1管PCR反应液，每管300μl；1管dNTPs混合液，每管40μl；1管阳性对照品，每管40μl和1管阴性对照品，每管40μl；2)核酸抽提，提取DNA需用紫外分光光度计测定浓度，OD260/280在1.8-2.2内；3)实时荧光PCR检测。优选地，所述步骤3)实时荧光PCR检测包括试剂准备，按照比例配置PCR反应液和dNTPs混合液的混合液，装入PCR反应管中备用；加样，提取的样本DNA分别加入PCR反应管中，待测样本基因组DNA浓度＞100ng，离心排除底管气泡；设置PCR程序，荧光检测通道选择SYBRGreenI/FAM检测通道。优选地，所述步骤3)实时荧光PCR检测还包括利用数据处理软件将检测结果归一化处理的步骤。优选地，所述PCR反应液和dNTPs混合液的混合液中PCR反应液和dNTPs混合液的比例为8∶1。本专利技术的有益效果是：能够快速、简便、有效地检测HER-2基因的扩增，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，有效提高了检测效率与检测通量，为HER-2基因在临床检测提供了更方便的选择。附图说明图1是本专利技术的数据处理软件的数据处理流程示意图；图2是本专利技术分析软件对非空白对照归一化熔解曲线数值计算负导数得到的熔解峰值曲线示意图；图3是本专利技术分析软件中把有两个峰的根据指定的峰作为参考峰的曲线示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术的附图，对本专利技术实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。本专利技术所揭示的一种检测HER-2基因扩增的试剂盒，包括PCR反应液，dNTP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测HER‑2基因扩增的试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液，dNTPs混合液，阳性对照品，阴性对照品和包装物，所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液，HER‑2基因特异性上游引物，HER‑2基因特异性下游引物，RPPH基因特异性上游引物，RPPH基因特异性下游引物，DNA聚合酶及饱和染料；所述HER‑2基因特异性上游引物F序列为：CTTAGCTGTCCTGTACACCA；所述HER‑2基因特异性下游引物R序列为：CCATATTCTGTGCTGGACGT；所述RPPH基因特异性上游引物F序列为：GCAGGAGATGCCGTGGAC；所述RPPH基因特异性下游引物R序列为：GGGTACCTCACCTCAGCCAT。
【技术特征摘要】
1.一种检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液，dNTPs混合液，阳性对照品，阴性对照品和包装物，所述PCR反应液包括PCR反应缓冲液，HER-2基因特异性上游引物，HER-2基因特异性下游引物，RPPH基因特异性上游引物，RPPH基因特异性下游引物，DNA聚合酶及饱和染料；所述HER-2基因特异性上游引物F序列为：CTTAGCTGTCCTGTACACCA；所述HER-2基因特异性下游引物R序列为：CCATATTCTGTGCTGGACGT；所述RPPH基因特异性上游引物F序列为：GCAGGAGATGCCGTGGAC；所述RPPH基因特异性下游引物R序列为：GGGTACCTCACCTCAGCCAT。2.根据权利要求1所述的检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于，PCR反应缓冲液包括40mM～60mMTris、1mM～3mMMgCl2、400mg～600mg/LBSA。3.根据权利要求2所述的检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应缓冲液包括50mMTris、2mMMgCl2、500mg/LBSA。4.根据权利要求1所述的检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs混合液包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。5.根据权利要求1所述的检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶采用热启动Taq酶，每反应用量为0.05U～0.1U。6.根据权利要求1所述的检测HER-2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述试...
【专利技术属性】
技术研发人员：翟云良，倪晓龙，苗保刚，李明，彭年才，
申请(专利权)人：苏州天隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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