一种香稻品种滇屯502香味基因单引物分子鉴定的方法技术

本发明专利技术公开一种香稻品种滇屯502香味基因单引物分子鉴定的方法。该方法对待鉴定水稻品种滇屯502后代群体移栽15‑40天挂牌标记单株，提取标记单株叶片总DNA，用自主设计的滇屯502香味功能基因的特异性引物BADS‑2进行PCR反应；用6％聚丙烯酰胺凝胶、1×TAE buffer、180V‑200v电泳3‑4h，银染，显色，依据电泳结果鉴定材料基因型，PCR产物分子量为189bp的水稻材料是香型。本发明专利技术能快速、有效鉴别香稻品种滇屯502及其杂交组合后代的香味基因。

Method for identifying single gene of fragrant gene of fragrant rice variety Dian Dian 502

The invention discloses a method for identifying a single primer molecule of fragrant rice variety Dian 502 fragrance gene. The approach to the identification of rice varieties diantun 502 progenies marked 40 days after transplanting 15 per plant, total DNA was extracted from the labeled leaf, with independent design diantun 502 fragrance gene specific primers BADS 2 PCR reaction; 6% polyacrylamide gel, 1 * TAE buffer, 180V 200V electrophoresis 3 4h, silver staining, color, on the basis of identification of electrophoresis results of genotypes, the molecular weight of the product is PCR 189bp of rice is fragrant. The invention can quickly and effectively identify the fragrance gene of the fragrant rice variety Dian 502 and the hybrid combination offspring.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一个水稻品种滇屯502香味基因单引物分子鉴定的方法，属于农业生物
，更具体地说属于育种领域。
技术介绍
由于优质香米具有良好的食用价值和很高的经济价值，所以稻米香味性状已成为一个重要的品质指标，受世界各稻米生产国科研人员的高度重视。在云南省多样性的生态环境中，不仅蕴藏丰富的稻种资源，而且已发展形成具有云南高原特色的优质米产业。几十年来，云南特色优质米品种年种植面积在100多万亩，年创造产值数十亿元，支撑了一批地方农业企业的发展，促进了当地农村经济持续发展和农民脱贫致富。在用于生产优质米的品种中，常年种植面积最大的是香软米品种滇屯502，该品种由于食味性好和香味浓郁，成为“云南六大名米”中四大名米的主要原料生产品种，年种植面积保持在30万亩左右。香米品种滇屯502是常规籼稻品种，在1993年通过云南省品种审定，并大面积推广应用，迄今在生产上应用了20多年。由于长期种植而又没有开展提纯复壮工作，该香米品种种性严重退化，影响了云南优质米产业的发展，因此开展滇屯502的提纯复壮和改良工作已迫在眉睫。我们研究发现滇屯502的香味性状主要受第8号染色体上的单隐性基因badh2控制,对该基因克隆分析找到了变异位点，并根据其碱基差异设计了一个特异引物鉴定该香味基因。大量现有研究表明水稻香味性状的遗传机制较为复杂，其主要受基因控制，还易受气候条件、土壤条件、微量元素等因素影响，因此对香味性状改良采用常规育种手段受限较大。
技术实现思路
为克服了传统香味鉴别方法的不足，本专利技术结合分子生物学手段从基因水平上对香稻品种滇屯502的香味基因进行鉴定，提供了一种单引物的准确、快速、高效的分子鉴定方法。本专利技术的技术方案如下：1.一种香稻品种滇屯502香味基因单引物分子鉴定的方法，包括以下步骤：(1)在待鉴定的水稻品种滇屯502后代群体材料移栽15～40天挂牌标记单株，提取标记单株叶片总DNA；(2)用香味功能基因特异性引物BADS-2进行PCR扩增反应，所述香味功能基因特异性引物BADS-2由上游引物BADS-2F和下游引物BADS-2R组成，所述上游引物BADS-2F的碱基序列如SEQIDNO：1所示，下游引物BADS-2R的碱基序列如SEQIDNO：2所示；(3)PCR扩增反应后上样1.5μl，用6％的聚丙烯酰胺凝胶，1×TAEbuffer，180V～200V电泳3～4h；(4)银染，显色，检测PCR扩增产物及电泳结果；用步骤(2)所述香味功能基因特异性引物BADS-2经PCR扩增后，基因型为非香型(+/+)的PCR产物分子量为197bp；基因型为香型(-/-)的PCR产物分子量为189bp；基因型为杂合型(+/-)的PCR产物分子量为197bp和189b；(5)PCR扩增产物分子量为189bp的水稻材料为香味水稻材料，其基因型为香型(-/-)。2.根据技术方案1所述的一种香稻品种滇屯502香味基因单引物分子鉴定的方法，步骤(2)所述用香味功能基因特异性引物BADS-2进行PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序为：反应液组成：反应总体积为15μl,其中ddH2O5.9μl，PCRMix7.5μl，50μmol上游引物BADS-2F0.3μl，50μmol下游引物BADS-2R0.3μl，100ng/μL模板DNA1μl；扩增程序：94℃预变性5min；从94℃变性30s，51℃退火30s至72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：利用了分子遗传学及分子生物学技术，结合香型及非香型在滇屯502香味基因的序列差异，设计特异性引物BADS-2，能快速准确鉴别滇屯502香味基因,为香味性状的选择提供了有力的工具。具体表现为：1、用滇屯502香味基因特异性引物BADS-2鉴别，检测的是香味基因自身的序列差异，鉴别准确率为100％，用时不超过3天，克服了环境不利干扰，加快滇屯502的复壮和改良，缩短育种年限，是一种快速有效选择鉴定的方法。2、分析过程只需提取DNA、PCR反应和电泳即可，鉴别方法简单易行，不受季节及材料数量的限制，而且鉴别方法经济，鉴定一个材料或个体仅需人民币约15元。3、本专利技术方法能快速、有效鉴定滇屯502及其后代，以及滇屯502杂交组合材料的香味基因，且能区分显性纯和、显性杂合两种植株的基因型。序列表中SEQIDNO：1所示的是香味功能基因特异性引物BADS-2的上游引物BADS-2F的碱基序列。序列表中SEQIDNO：2所示的是香味功能基因特异性引物BADS-2的下游引物BADS-2R的碱基序列。附图说明图1是用香味功能基因特异性引物BADS-2对水稻材料叶片提取的总DNA经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳所得到的电泳图谱，其中M表示DNAladdermarker；泳道1为滇屯502，泳道2、3、7、12、13、15为滇屯502后代香型材料，其PCR产物分子量为189bp，基因型为纯和香型(-/-)；泳道4、5、6分别为三个非香型亲本材料9311，明恢63和C418，泳道8～11,14，16为非香型材料，其PCR产物分子量为197bp，基因型为纯和非香型(+/+)；泳道17为滇屯502后代杂合型材料的PCR扩增产物带型，其PCR产物分子量为197bp和189bp，基因型为杂合非香型(+/-)。具体实施方式具体实施方式是跟踪分析香稻品种滇屯502的3个后代群体，对每个群体单株分别用叶片KOH法浸泡法及本专利技术分子鉴定法鉴定水稻材料的香味基因型，比较两种方法鉴别结果，考察本专利技术分子鉴别法的快速、经济和准确性。实验水稻材料：滇屯502，水稻品种9311，明恢63和水稻C418均为市售。以下各实施例无特殊说明的为常规方法。实施例1利用自主设计开发的滇屯502香味基因特异引物BADS-2对待鉴定的水稻材料：滇屯502，水稻品种9311，明恢63和水稻C418四个亲本材料进行香味基因PCR鉴定。滇屯502，水稻品种9311，明恢63和水稻C418四个待鉴定的水稻亲本材料的鉴定均按如下步骤进行：(1)在待鉴定的水稻材料移栽15天挂牌标记单株，用CTAB法提取标记单株叶片总DNA；(2)用香味功能基因特异性引物BADS-2进行PCR扩增反应，所述香味功能基因特异性引物BADS-2由上游引物BADS-2F和下游引物BADS-2R组成，所述上游引物BADS-2F的碱基序列如SEQIDNO：1所示，下游引物BADS-2R的碱基序列如SEQIDNO：2所示；所述PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序为：反应液组成：反应总体积为15μl,其中ddH2O5.9μl，PCRMix7.5μl，50μmol上游引物BADS-2F0.3μl，50μmol下游引物BADS-2R0.3μl，100ng/μL模板DNA1μl；扩增程序：94℃预变性5min；从94℃变性30s，51℃退火30s至72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。(3)PCR扩增反应后上样1.5μl，用6％的聚丙烯酰胺凝胶，1×TAEbuffer，200V电泳3h；(4)银染，显色，检测PCR扩增产物及电泳结果；依据电泳结果鉴定材料基因型,电泳结果详见图1。根据电泳结果可知，9311、明恢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香稻品种滇屯502香味基因单引物分子鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)在待鉴定的水稻品种滇屯502后代群体移栽15～40天挂牌标记单株，提取标记单株叶片总DNA；(2)用香味功能基因特异性引物BADS‑2进行PCR扩增反应，所述香味功能基因特异性引物BADS‑2由上游引物BADS‑2F和下游引物BADS‑2R组成，所述上游引物BADS‑2F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物BADS‑2R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；(3)PCR扩增反应后上样1.5μl，用6％的聚丙烯酰胺凝胶，1×TAE buffer，180V～200V电泳3～4h；(4)银染，显色，检测PCR扩增产物及电泳结果；(5)PCR扩增产物分子量为189bp的水稻材料为香味水稻材料。

【技术特征摘要】
1.一种香稻品种滇屯502香味基因单引物分子鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)在待鉴定的水稻品种滇屯502后代群体移栽15～40天挂牌标记单株，提取标记单株叶片总DNA；(2)用香味功能基因特异性引物BADS-2进行PCR扩增反应，所述香味功能基因特异性引物BADS-2由上游引物BADS-2F和下游引物BADS-2R组成，所述上游引物BADS-2F的碱基序列如SEQIDNO：1所示，下游引物BADS-2R的碱基序列如SEQIDNO：2所示；(3)PCR扩增反应后上样1.5μl，用6％的聚丙烯酰胺凝胶，1×TAEbuffer，180V～200V电泳3～4h；(4)银染...

【专利技术属性】
技术研发人员：张江丽，文建成，李娟，普世皇，谭亚玲，普有华，谭学林，金寿林，陈丽娟，董陈文华，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53