本发明专利技术公开了一株双基因敲除工程菌及其构建方法和在发酵生产1,3‑丙二醇中的应用。将产1,3‑丙二醇的野生型菌株的基因组中的D‑乳酸脱氢酶基因和α‑乙酰乳酸合成酶基因同时敲除后获得的工程菌株，所述的产1,3‑丙二醇的野生型菌株是以甘油为原料发酵生产1,3‑丙二醇。同时敲除乳酸脱氢酶及乙酰乳酸合成酶两个基因后获得的工程菌应用在发酵法生产1,3‑丙二醇过程中，在发酵液中1,3‑丙二醇占代谢产物比例增加，乳酸与2,3‑丁二醇合成同时大幅度减少，其它副产物没有显著增加。本发明专利技术将在微生物发酵法生产1,3‑丙二醇过程中发挥提高工程菌种合成1,3‑丙二醇所占比例、降低合成副产物比例的作用，有利于降低生产成本，具有重要应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一株同时敲除乳酸脱氢酶和乙酰乳酸合成酶基因的工程菌及其构建方法和在发酵生产1,3-丙二醇中的应用。
技术介绍
：1,3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂，应用于耐压高润滑剂、染料、油墨、防冻剂等行业。PDO可用来合成聚酯和聚氨酯、杂环、药物中间体等，主要用于合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美国评为六大石化新产品之一。PTT与PET、PBT相比除具有聚酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如尼龙的弹性恢复性，在全范围无需添加特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性，抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性，抗内应力，低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性，可循还利用性等。由于PTT的具有以上优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。生产PTT纤维的关键在于单体原料PDO的来源。PTT占领市场的关键在于价格，而PTT的价格主要取决于PDO的价格。由于不能廉价制得PDO，制约了PTT的研制和市场开拓。直到90年代中期PDO实现了工业化生产，使得PDO价格大大降低，PTT才开始工业化生产和应用。杜邦和壳牌两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产PDO。化学合成法生产PDO的缺点是副产物多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备投资巨大，原料不可再生；同时由于产量有限，长期以来PDO售价偏高。目前1,3-丙二醇的生产方法主要是微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有显著的优点：1、利用成本较低的可再生资源(如甘油、玉米、淀粉)为原料；2、生产条件温和，操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境污染小。微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。微生物发酵法生产1,3-丙二醇是利用微生物发酵甘油产生。至今所有被发现的1,3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有较高的1,3-丙二醇转化率和1,3-丙二醇生产强度，具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。目前被用来生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌主要分离自土壤环境中。克雷伯氏菌只能利用甘油(不能利用糖类)产生1,3-丙二醇。在产生1,3-丙二醇的过程中，甘油发生岐化反应，氧化途径中的产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，在氧化产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1,3-丙二醇。氧化途径中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸可能转化为多种发酵副产物，如乳酸、2,3-丁二醇、丁二酸、乙酸、乙醇等。1摩尔丙酮酸生成1摩尔乳酸的过程要消耗1摩尔还原力，2摩尔丙酮酸生成1摩尔2,3-丁二醇的过程要消耗1摩尔还原力，而1摩尔丙酮酸生成琥珀酸的过程要消耗2摩尔还原力；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，甲酸再分解为CO2和H2；乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中生成过量的ATP，而在经乙醛形成乙醇的反应中要消耗2摩尔还原力。还原途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶B12的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙醛；第二步，由1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成1,3-丙二醇，此过程消耗1摩尔还原力。根据克雷伯氏菌发酵甘油的代谢途径，在发酵过程中，细胞利用底物甘油发酵的代谢产物除主产物1,3-丙二醇外，还有乳酸、2,3-丁二醇、乙醇、乙酸、丁二酸等主要副产物。副产物合成对发酵生产1,3-丙二醇主要具有三方面不利影响：1)消耗底物甘油，降低底物对1,3-丙二醇的转化率；2)积累较高浓度副产物时对细胞继续发酵形成较强抑制作用，妨碍得到高浓度1,3-丙二醇发酵液，同时也降低了发酵液中目标产物1,3-丙二醇在整个代谢产物中的所占比例；3)从发酵液提取1,3-丙二醇时，副产物较多会增加分离提纯1,3-丙二醇难度与成本。在主要副产物中，又以乳酸和2,3-丁二醇的产量最多，文献报道野生型克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇的过程中副产物乳酸产量最高可达40g/L以上；其次是2,3-丁二醇，产量最高可达30g/L以上。因此，减少副产物的生成，尤其是减少乳酸和2,3-丁二醇的生产，对提高发酵甘油生成1,3-丙二醇水平，降低发酵生产1,3-丙二醇成本，具有重要的意义。研究报道单独敲除乳酸合成代谢途径中乳酸脱氢酶基因，可以大幅度减少乳酸合成，但同时2,3-丁二醇合成大幅度增加，说明切断乳酸合成代谢途径，代谢流主要转向2,3-丁二醇合成，不能明显提升1,3-丙二醇在总的代谢产物中所占比例；而单独敲除2,3-丁二醇合成代谢途径中的关键催化酶基因，可以大幅度减少2,3-丁二醇合成，但同时乳酸合成大幅度增加。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种同时敲除乳酸与2,3-丁二醇合成代谢途径编码基因的双基因敲除工程菌及其构建方法及其在生产1，3-丙二醇中应用。我们的前期研究发现敲除克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶编码基因，发酵液中合成乳酸浓度可达到野生菌的2倍以上，说明切断2,3-丁二醇合成代谢途径，代谢流主要转向乳酸合成，也不能明显提升1,3-丙二醇在总的代谢产物中所占比例。如果同时切断乳酸与2,3-丁二醇合成代谢途径，代谢流是主要转向1,3-丙二醇合成还是转向其它代谢副产物合成途径？如转向合成乙酸、乙醇或丁二酸？是不是可以提升1,3-丙二醇在所有代谢产物中的比例？鉴于克雷伯氏菌代谢网络的复杂性，存在多种代谢副产物合成途径，加上对双基因敲除工程菌的甘油代谢动力学的不可预测性，我们不能判定同时切断乳酸与2,3-丁二醇合成代谢途径对克雷伯氏菌发酵甘油生产1,3-丙二醇的影响。由于对克雷伯氏菌进行连续基因敲除的遗传操作的存在一定技术难度，因此研究同时敲除乳酸脱氢酶与乙酰乳酸合成酶对发酵生产1,3-丙二醇的影响具有创新性。本专利技术的双基因敲除工程菌，其是通过以下方法构建的，是将产1,3-丙二醇的野生型菌株的基因组中的D-乳酸脱氢酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因同时敲除后获得的工程菌株，所述的产1,3-丙二醇的野生型菌株是以甘油为原料发酵生产1,3-丙二醇。所述的1，3-丙二醇的野生型菌株优选为克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌，进一步优选为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。所述的将肺炎克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同时敲除，优选通过以下方法敲除：a、PCR扩增肺炎克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因，将其与克隆载体相连，然后再导入含Red重组酶质粒pKD46的大肠杆菌Dh5a中，得到含有Red重组酶质粒pKD46及乳酸脱氢酶基因克隆载体的大肠杆菌Dh5a；b、设计与乳酸脱氢酶基因序列同源的两侧翼各～40bp的引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株双基因敲除工程菌的构建方法，其特征在于，是将产1,3‑丙二醇的野生型菌株的基因组中的D‑乳酸脱氢酶基因和α‑乙酰乳酸合成酶基因同时敲除后获得的工程菌株，所述的产1,3‑丙二醇的野生型菌株是以甘油为原料发酵生产1,3‑丙二醇。
【技术特征摘要】
1.一株双基因敲除工程菌的构建方法，其特征在于，是将产1,3-丙二醇的野生型菌株的基因组中的D-乳酸脱氢酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因同时敲除后获得的工程菌株，所述的产1,3-丙二醇的野生型菌株是以甘油为原料发酵生产1,3-丙二醇。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的产1,3-丙二醇的野生型菌株为克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的产1,3-丙二醇的野生型菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述将肺炎克雷伯氏菌的基因组中的D-乳酸脱氢酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因同时敲除是通过RED同源重组基因敲除方法将D-乳酸脱氢酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因敲除。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的将肺炎克雷伯氏菌的D-乳酸脱氢酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因敲除同时敲除，是通过以下方法敲除：a、PCR扩增肺炎克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因，将其与克隆载体相连，然后再导入含Red重组酶质粒pKD46的大肠杆菌Dh5a中，得到含有Red重组酶质粒pKD46及乳酸脱氢酶基因克隆载体的大肠杆菌Dh5a；b、设计与乳酸脱氢酶基因序列同源的两侧翼各～40bp的引物，以质粒pIJ773为模板，PCR扩增Apra+筛选抗性基因盒，纯化得到两侧与乳酸脱氢酶基因同源的Apra+筛选抗性基因盒DNA片段；c、将步骤b获得的两侧与乳酸脱氢酶基因同源的Apra+筛选抗性基因盒DNA片段电转化导入含有Red重组酶质粒pKD46及乳酸脱氢酶基因克隆载体的大肠杆菌Dh5a中；诱导Red重组酶表达，两侧与乳酸脱氢酶基因同源的Apra+筛选抗性基因盒DNA片段与乳酸脱氢酶基因克隆载体之间基因同源重组，通过Apra+抗性筛选出含重组片段的克隆菌；d、通过PCR扩增两端为长侧翼同源片段，中间为Apra+抗性筛选标记基因盒的DNA片段；e、将步骤d获得的DNA片段电转化导入含有Red重组酶质粒pIJ790的野生型克雷伯氏菌中，诱导Red重组酶表达，两端长侧翼同源片段与乳酸脱氢酶基因之间发生基因同源重组，将Apra+抗性基因盒插入到乳酸脱氢酶基因中间，通过Apra+抗性筛选出重组菌，即乳酸脱氢酶基因失活的克雷伯氏菌；f、向步骤d获得的乳酸脱氢酶基因失活的克雷伯氏菌中电转入pCP20质粒，诱导重组酶表达，通过Apr...
【专利技术属性】
技术研发人员：周胜，秦启伟，王著希，黄友华，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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