一种明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法，属于超氧化物歧化酶技术领域，步骤包括：粉碎并干燥明绿豆、提取明绿豆超氧化物歧化酶、热水浴处理、离心过滤得到上清液Ⅰ和滤渣Ⅰ、硫酸铵分级沉淀、过G‑200葡聚糖凝胶柱、无水石油醚提取滤渣Ⅰ、95%乙醇浸提混合物Ⅱ、乙醚溶解膏状物Ⅰ、丙酮溶解膏状物Ⅱ、粉碎泡沫状固体、混合溶剂溶解粉末状提取物Ⅰ、在混合溶液Ⅰ中加入胆固醇、注射超氧化物歧化酶磷酸缓冲液、减压干燥和磷酸盐缓冲溶液溶解等步骤；本发明专利技术利用明绿豆提取的滤渣制备明绿豆超氧化物歧化酶脂质体，方法简单，制备的超氧化物歧化酶脂质体具有包封率高，性质稳定，包埋成本低，制备原料普遍等特点，有利于明绿豆的综合利用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种绿豆提取物及其制备方法，特别是涉及一种明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法。
技术介绍
绿豆(Vigna radiate L.)，为豆科草本植物绿豆(Phaseolusradiatus)的成熟种子。现代药理研究表明绿豆具有抗菌抑菌、抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力、降血脂、及解毒等作用。明光绿豆(以下简称“明绿豆”)，主产于明光市明东、石坝、涧溪、管店等乡镇。以其色泽晶莹碧绿，粒大皮薄、汤清易烂，清香可口等特点，质量为全国之冠，被誉为“明绿”，曾经被作为贡品。2008年“明光绿豆”被列为“国家地理标志保护产品”，并获得注册商标。经检测：明光绿豆的种子中脂肪含量为0.90%，灰分含量为3.70%，绝对水分含量为11.80%，蛋白质含量为25.26%，碳水化合物含量为58.34%。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，是广泛存在于生物体内的一类金属蛋白酶，具有催化超氧离子自由基(O2－)歧化反应的特异作用，被医学界誉为“人体清道夫”。超氧化物歧化酶能快速有效地清除体内的超氧自由基，在防止生物体免受超氧自由基损伤，抗辐射、抗肿瘤、提高人体免疫力、抗压力和疲劳，预防局部缺血再灌注损伤，治疗动脉血管粥样硬化，治疗脂溢性皮肤炎症及延缓机体衰老等方面起到重要作用，在食品、农业及化妆品行业的应用也越来越广泛。但是过去大多从血液中提取，不仅工艺复杂、制备成本高、不易常温保存，且存在艾滋病等血液病毒交叉感染的潜在危险，国际卫生组织已停止动物性超氧化物歧化酶的使用。植物超氧化物歧化酶则有较高的使用安全性，所以，从植物源中获取超氧化物歧化酶正成为热点。经检索，尚未检索到明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种综合利用明绿豆的自身成分制备明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的方法。本专利技术提供了一种明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法，具体流程步骤为：a)粉碎并干燥明绿豆；b)超声辅助pH7磷酸盐缓冲液提取明绿豆超氧化物歧化酶，得到混合物Ⅰc)将混合物Ⅰ用42~45℃的热水水浴1~3h；d)将水浴处理后的混合物Ⅰ在温度2~6℃的条件下离心，离心后过滤得到上清液Ⅰ和滤渣Ⅰ；e)将硫酸铵加入到上清液Ⅰ中，配制成硫酸铵含量为30~38%的溶液，静置后离心，过滤得到上清液Ⅱ和滤渣Ⅱ，取上清液Ⅱ，继续加硫酸铵，至上清液Ⅱ的硫酸铵含量为60~70%，完全溶解后二次离心，二次过滤得到上清液Ⅲ和沉淀物Ⅰ；f)将沉淀物Ⅰ复溶至水中，用pH6.8±0.1的磷酸盐缓冲液进行透析，透析完成后过G-200葡聚糖凝胶柱，得到明绿豆超氧化物歧化酶磷酸盐缓冲液；g)将滤渣Ⅰ用无水石油醚提取，提取完成后取固体部分，称为混合物Ⅱ；h)将混合物Ⅱ用95％乙醇溶液浸提，过滤去除不溶物并将滤液真空浓缩，得到膏状物Ⅰ；i)用乙醚溶解真空浓缩得到的膏状物Ⅰ，溶解后过滤，并将滤液置于20~30℃的环境中减压蒸发，得到膏状物Ⅱ；j)再用丙酮溶解膏状物Ⅱ，溶解后过滤，并将滤液真空冷冻干燥，得到泡沫状固体；k)将泡沫状固体粉碎，得到粉末状提取物Ⅰ；l)将粉末状提取物Ⅰ完全溶解在甲醇、乙醇、正己烷的混合溶剂中，得到混合溶液Ⅰ；m)在混合溶液Ⅰ中加入胆固醇，得到混合溶液Ⅱ；n)所述明绿豆超氧化物歧化酶磷酸盐缓冲液加入到混合溶液Ⅱ中，料液比为1:4~1:5，得到混合溶液Ⅲ；o)减压干燥去除混合溶液Ⅲ中溶剂，得到超氧化物歧化酶脂质膜；p)在超氧化物歧化酶脂质膜中加入pH7.2±0.1的磷酸盐缓冲溶液，使超氧化物歧化酶脂质膜完全溶解，得到稳定的明绿豆超氧化物歧化酶脂质体。1.根据权利要求1所述的明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法，其特征在于：在步骤j中，所述混合溶剂各成分的配比为：甲醇：乙醇：正己烷=70:50:1。2.根据权利要求1所述的明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法，其特征在于：在步骤k中，所述胆固醇的添加量为0.3~2.5%（W/V）。3.根据权利要求1所述的明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法，其特征在于：在步骤m中，所述减压干燥的条件为在45~55℃，0.01~0.2MP的条件下减压干燥。有益效果申请人在明绿豆超氧化物歧化酶的提取过程中，发现采用提取过程中的滤渣Ⅰ作为原料，进一步通过95%乙醇溶液，乙醚和丙酮提纯后，再与提取的超氧化物歧化酶、胆固醇混合后，经过磁力搅拌，减压干燥等手段，即可制备出稳定性较高的超氧化物歧化酶脂质体。得到的活性超氧化物歧化酶脂质体的活性包埋率为：88.73%，可见，本专利技术的超氧化物歧化酶未影响到超氧化物歧化酶的活性。本专利技术从明绿豆自身寻找出保护明绿豆超氧化物歧化酶的方法，不仅能够保护从明绿豆中提取出来的超氧化物歧化酶，而且综合利用了明绿豆超氧化物歧化酶提取过程中的废料，包埋的物质为明绿豆自身的天然成分，在提取明绿豆超氧化物歧化酶的同时提取明绿豆中的天然包埋成分，并连续对提取出来的超氧化物歧化酶进行包埋处理，制备出的超氧化物歧化酶脂质体具有包封率高，性质稳定，包埋成本低，制备原料普遍等特点。该制备脂质体的方法简单，完全融合在明绿豆超氧化物歧化酶的提取工艺中，仅仅采用了超氧化物歧化酶提取后的废弃物，对明绿豆超氧化物歧化酶进行包埋处理的方法。本专利技术提供了一种全新的明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法。附图说明图1：经过实施例1的方法制备的明绿豆超氧化物歧化酶脂质体电子显微镜图像；图2：超声辅助提取的明绿豆超氧化物歧化酶电子显微镜图像。具体实施方式下面结合具体实施例子进一步阐明本专利技术，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围，在阅读了本专利技术之后，本领域的技术人员对本专利技术各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所规定的范围。实施例1一种明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法，采用明绿豆、胆固醇为原料制备而成，明绿豆由安徽燕之坊食品有限公司提供，胆固醇为食品级。具体操作方法包括如下步骤：1.粉碎并干燥明绿豆：用粉碎设备将明绿豆粉碎，采用真空干燥设备在温度为40℃，真空度20-80kPa的条件下减压干燥，并过80目的筛，得到明绿豆粉末。2.提取明绿豆超氧化物歧化酶：将明绿豆粉末加入pH7磷酸盐缓冲液，采用液固比22:1（mL/g）、超声功率120w，温度为44℃的条件下超声辅助提取明绿豆粉末90min，提取完成后得到混合物Ⅰ。3.热水浴处理：将上述混合物Ⅰ用44℃的热水水浴2h。4.离心：将水浴处理后的混合物Ⅰ在温度4℃，离心转数10000r/min的条件下离心20 min，过滤得到上清液Ⅰ和滤渣Ⅰ。5.硫酸铵分级沉淀：将固体硫酸铵粉末加入上清液Ⅰ中，用上清液Ⅰ配制硫酸铵含量为35%的溶液，磁力搅拌30 min，在4℃的环境中静置4 h，以12000 r/min的转数离心20 min；离心后得到上清液Ⅱ，取上清液Ⅱ，继续加固体硫酸铵粉末，至上清液Ⅱ的硫酸铵含量为65%，然后在4℃的环境中，继续以12000 r/min的转数离心20 min，得到上清液Ⅲ和沉淀物Ⅰ。6.过G-200葡聚糖凝胶柱：将沉淀物Ⅰ复溶至水中，于pH 6.7的磷酸盐缓冲液中透析，过G-200葡聚糖凝胶柱，得到明绿豆超氧化物歧化酶磷酸盐缓冲液。7.无水石油醚提取滤渣：将滤渣Ⅰ在40℃的条本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法，所述制备方法包括步骤：粉碎并干燥明绿豆，超声辅助pH7磷酸盐缓冲液提取明绿豆超氧化物歧化酶，得到混合物Ⅰ；其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：将混合物Ⅰ用42~45℃的热水水浴1~3h；将水浴处理后的混合物Ⅰ在温度2~6℃的条件下离心，离心后过滤得到上清液Ⅰ和滤渣Ⅰ；将硫酸铵加入到上清液Ⅰ中，配制成硫酸铵含量为30~38%的溶液，静置后离心，过滤得到上清液Ⅱ和滤渣Ⅱ，取上清液Ⅱ，继续加硫酸铵，至上清液Ⅱ的硫酸铵含量为60~70%，完全溶解后二次离心，二次过滤得到上清液Ⅲ和沉淀物Ⅰ；将沉淀物Ⅰ复溶至水中，用pH 6.8±0.1的磷酸盐缓冲液进行透析，透析完成后过G‑200葡聚糖凝胶柱，得到明绿豆超氧化物歧化酶磷酸盐缓冲液；将滤渣Ⅰ用无水石油醚提取，提取完成后取固体部分，称为混合物Ⅱ；将混合物Ⅱ用95％乙醇溶液浸提，过滤去除不溶物并将滤液真空浓缩，得到膏状物Ⅰ；用乙醚溶解真空浓缩得到的膏状物Ⅰ，溶解后过滤，并将滤液置于20~30℃的环境中减压蒸发，得到膏状物Ⅱ；再用丙酮溶解膏状物Ⅱ，溶解后过滤，将滤液真空冷冻干燥，得到泡沫状固体；将泡沫状固体粉碎，得到粉末状提取物Ⅰ；将粉末状提取物Ⅰ完全溶解在甲醇、乙醇、正己烷的混合溶剂中，得到混合溶液Ⅰ；在混合溶液Ⅰ中加入胆固醇，得到混合溶液Ⅱ；所述明绿豆超氧化物歧化酶磷酸盐缓冲液加入到混合溶液Ⅱ中，料液比为1:4~1:5，得到混合溶液Ⅲ；减压干燥去除混合溶液Ⅲ中溶剂，得到超氧化物歧化酶脂质膜；在超氧化物歧化酶脂质膜中加入pH 7.2±0.1的磷酸盐缓冲溶液，使超氧化物歧化酶脂质膜完全溶解，得到稳定的明绿豆超氧化物歧化酶脂质体。...

【技术特征摘要】
1.一种明绿豆超氧化物歧化酶脂质体的制备方法，所述制备方法包括步骤：粉碎并干燥明绿豆，超声辅助pH7磷酸盐缓冲液提取明绿豆超氧化物歧化酶，得到混合物Ⅰ；其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：将混合物Ⅰ用42~45℃的热水水浴1~3h；将水浴处理后的混合物Ⅰ在温度2~6℃的条件下离心，离心后过滤得到上清液Ⅰ和滤渣Ⅰ；将硫酸铵加入到上清液Ⅰ中，配制成硫酸铵含量为30~38%的溶液，静置后离心，过滤得到上清液Ⅱ和滤渣Ⅱ，取上清液Ⅱ，继续加硫酸铵，至上清液Ⅱ的硫酸铵含量为60~70%，完全溶解后二次离心，二次过滤得到上清液Ⅲ和沉淀物Ⅰ；将沉淀物Ⅰ复溶至水中，用pH 6.8±0.1的磷酸盐缓冲液进行透析，透析完成后过G-200葡聚糖凝胶柱，得到明绿豆超氧化物歧化酶磷酸盐缓冲液；将滤渣Ⅰ用无水石油醚提取，提取完成后取固体部分，称为混合物Ⅱ；将混合物Ⅱ用95％乙醇溶液浸提，过滤去除不溶物并将滤液真空浓缩，得到膏状物Ⅰ；用乙醚溶解真空浓缩得到的膏状物Ⅰ，溶解后过滤，并将滤液置于20~30℃的环境中减压蒸发，得到膏状物Ⅱ；再用丙酮溶解膏状物...

【专利技术属性】
技术研发人员：李梅青，王星，张瑜，代蕾莉，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34