脂质体颗粒、制备所述脂质体颗粒的方法以及其用途技术

被称为小单层囊泡(SUV)的脂质体可在20‑50nm大小范围内合成，但遭遇如不稳定性和导致颗粒间融合的聚集的挑战。这限制其作为治疗递送剂的用途。经由连接阴离子实体如DNA/RNA来增加SUV的表面负电荷使这些囊泡的胶体稳定性提高。另外，不同于其线性对应物，核酸的致密球形布置和径向取向表现出独特的化学和生物特性。这些脂质体是无毒的，并且虽然是阴离子的，但能够以非免疫原性方式有效地进入细胞而无需辅助阳离子转染剂的帮助。这些例外特性允许其用作不同疗法中的基因调控的递送剂并且提供金属核心球形核酸的替代平台。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用根据美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2013年12月3日提交的美国临时申请第61/911,334号和2014年4月21日提交的美国临时申请第61/982,269号的优先权，其公开内容以引用的方式整体并入本文。政府利益声明本专利技术是根据由美国国防部高级研究计划局(Defense Advanced Research Project Agency)授予的HR0011-13-2-0018和由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA151880在政府支持下进行的。政府对本专利技术具有某些权利。序列表本申请含有呈计算机可读形式的序列表(文件名：2013-201_SeqListing.txt；创建：2014年12月3日；1,893字节)作为公开内容的单独部分，所述序列表以引用的方式整体并入本文。专利
本公开涉及脂质体颗粒、制备所述脂质体颗粒的方法以及其用途。脂质体颗粒适用于基因调控和药物递送。技术背景已探索化学来产生脂质体和小单层囊泡(SUV)。例如，Vogel等人,\DNA Controlled Assembly of Lipid Membranes\，美国专利公布号2010/0144848公开用两个亲脂性锚修饰的DNA可形成脂质体或SUV。这种后修饰技术不利于高表面密度修饰。Hook等人,\Oligonucleotides Related to Lipid Membrane Attachment\，美国专利公布号2013/0252852描述所产生的脂质体或SUV具有寡核苷酸，所述寡核苷酸具有核酸的第一链和第二链以及位于其末端中的两个或更多个疏水性锚定部分，其中所述疏水性锚定部分在双层中发现。因为两个胆固醇分子用于将分子锚定至脂质双层中，所以这种后修饰技术不利于高表面密度修饰。Lu等人,\Amphiphilic Substances and Functionalized Lipid Vesicles Including the Same\，美国专利公布号2010/0166842描述包含彼此杂交的至少两个核苷酸区段的脂质体SUV。这种基于囊泡的非后修饰技术在稳定囊泡方面不那么有效，因为它在纸质双层的两侧上均并入稳定化部分。非专利文献也揭示了用于产生脂质体和SUV的化学，但这些化学各自也具有其问题。例如，\Liposome-Anchored Vascular Endothelial Growth Factor Aptamers\Bioconjugate Chem.,1998,9,573-582描述了适体DNA功能化的脂质体的合成以及其针对选择性癌细胞靶向的应用。通过这种方法产生的大小为平均80纳米的脂质体在双脂质层的两侧上均具有适体DNA分子，并且未展示基因调控。\Reversible Cell-Specific Drug Delivery with Aptamer-Functionalized Liposomes\Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,6494–6498描述适体DNA功能化的脂质体的合成以及其针对选择性癌细胞靶向和药物递送的应用。通过这种方法产生的平均140纳米与200纳米之间的脂质体利用胆固醇单元来将DNA锚定至双脂质层中，在双脂质层的两侧上均包含适体DNA分子，并且未表现出基因调控。\Selective delivery of an anticancer drug with aptamer-functionalized liposomes to breast cancer cells in vitro and in vivo\J.Mater.Chem.B,2013,1,5288公开了适体DNA功能化的脂质体的合成以及其针对选择性癌细胞靶向和药物递送的应用。此工作是在以上\Reversible Cell-Specific Drug Delivery with Aptamer-Functionalized Liposomes\中公开的研究的延伸。如同之前，这些颗粒利用胆固醇单元来将DNA锚定至脂质双层中，在双脂质层的两侧上均包含适体DNA分子，并且未表现出基因调控。\Phospholipid Membranes Decorated by Cholesterol-Based Oligonucleotides as Soft Hybrid Nanostructures\J.Phys.Chem.B,2008,112,10942–10952表征了胆固醇DNA功能化的脂质体。在该报道中，大小为33至35nm的脂质体是从1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)脂质制备的且用胆固醇修饰的DNA分子后功能化。所述报道未展示基因调控，并且这些颗粒利用胆固醇单元来将DNA锚定至脂质双层中。\Bivalent Cholesterol-Based Coupling of Oligonucleotides to Lipid Membrane Assemblies\J.Am.Chem.Soc.2004,126,10224-10225描述了用于锚定至脂质双层中的含有两个胆固醇单元的部分双链体的DNA链的开发。使用两个胆固醇单元来将DNA链锚定至脂质双层中导致与脂质体缔合的寡核苷酸的表面密度降低。在\Quantification of Oligonucleotide Modifications of Small Unilamellar Lipid Vesicles\Anal.Chem.2006,78,7493-7498中，研究者描述了用于定量功能化的脂质体纳米颗粒上的DNA链的技术的发展。所描述的颗粒包含含有用于锚定至脂质双层中的两个胆固醇单元的部分双链体的DNA链。使用两个胆固醇单元来将DNA链锚定至脂质双层中导致与脂质体缔合的寡核苷酸的表面密度降低。\Single-Molecule Detection and Mismatch Discrimination of Unlabeled DNA Targets\Nano Lett.2008,8,183-188公开了用含有两个胆固醇单元的部分双链体的
DNA链功能化的100纳米大小的脂质体。此工作是在上述\Bivalent Cholesterol-Based Coupling of Oligonucleotides to Lipid Membrane Assemblies\和\Quantification of Oligonucleotide Modifications of Small Unilamellar Lipid Vesicles\中公开的研究的延伸。如同之前，这些颗粒包含含有用于锚定至脂质双层中的两个胆固醇单元的部分双链体的DNA链。使用两个胆固醇单元来将DNA链锚定至脂质双层中导致与脂质体缔合的寡核苷酸的表面密度降低。\DNA-Induced Programmable Fusion of Phospholipid Vesicles\J.Am.Chem.Soc.2007,129,9584-9585是关于胆固醇DNA功能化的脂质体纳米颗粒的融本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂质体颗粒，所述脂质体颗粒具有大致上球形的几何形状，所述脂质体颗粒包含：脂质双层，其包含多个脂质基团；以及寡核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.03 US 61/911,334;2014.04.21 US 61/982,2691.一种脂质体颗粒，所述脂质体颗粒具有大致上球形的几何形状，所述脂质体颗粒包含：脂质双层，其包含多个脂质基团；以及寡核苷酸。2.如权利要求1所述的脂质体颗粒，其中所述多个脂质基团包含选自由脂质的磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油以及磷脂酰乙醇胺家族组成的组的脂质。3.如权利要求2所述的脂质体颗粒，其中所述脂质选自由以下各项组成的组：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)以及1,2-双十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。4.如权利要求1-3中任一项所述的脂质体颗粒，其中所述寡核苷酸是含有亲脂性栓系基团的寡核苷酸-脂质缀合物，其中所述亲脂性栓系基团被吸附至所述脂质双层中。5.如权利要求4所述的脂质体颗粒，其中所述亲脂性栓系基团包含生育酚或胆固醇。6.如权利要求5所述的脂质体颗粒，其中生育酚选自由生育酚衍生物α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚以及δ-生育酚组成的组。7.如权利要求1-6中任一项所述的脂质体颗粒，其中所述寡核苷酸包含RNA或DNA。8.如权利要求7所述的脂质体颗粒，其中所述RNA是非编码RNA。9.如权利要求8所述的脂质体颗粒，其中所述非编码RNA是抑制性RNA(RNAi)。10.如权利要求8或权利要求9所述的脂质体颗粒，其中所述RNAi选自由小抑制性RNA(siRNA)、与双链DNA形成三链体的单链RNA(ssRNA)以及核酶组成的组。11.如权利要求8或权利要求9所述的脂质体颗粒，其中所述RNA是微RNA。12.如权利要求7所述的脂质体颗粒，其中所述DNA是反义DNA。13.如权利要求1-12中任一项所述的脂质体颗粒，其中所述脂质体颗粒的直径小于或等于约50纳米。14.如权利要求1-13中任一项所述的脂质体颗粒，其中所述颗粒包含约10至约80个寡核苷酸。15.如权利要求14所述的脂质体颗粒，其中所述颗粒包含70个寡核苷酸。16.如权利要求1-15中任一项所述的脂质体颗粒，其中所述寡核苷酸是修饰的寡核苷酸。17.一种制备脂质体颗粒的方法，所述方法包括：将磷脂添加至溶剂以形成第一混合物，所述第一混合物包含多个脂质体；破坏所述多个脂质体以产生第二混合物，所述第二混合物包含脂质体和小单层囊泡(SUV)；从所述第二混合物分离所述SUV，所述SUV具有约20纳米与50纳米之间的颗粒大小；将寡核苷酸添加至所述分离的SUV以制备所述脂质体颗粒。18.如权利要求17所述的方法，其中所述第一混合物中的所述多个脂质体的颗粒大小在约100纳米与150纳米之间。19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述第二混合物中的所述脂质体和所述SUV的颗粒大小在约20纳米与约150纳米之间。20.如权利要求17所述的方法，其中所述脂质体颗粒具有小于或等于约50纳米的颗粒大小。21.如权利要求17-20中任一项所述的脂质体颗粒，其中所述寡核苷酸是含有亲脂性栓系基团的寡核苷酸-脂质缀合物，其中所述亲脂性栓系基团...

【专利技术属性】
技术研发人员：查德·A·米尔金，松兵·T·恩吉耶，雷沙姆·辛格·邦加，纳塔利·切尔尼亚克，谢尔盖·格里亚兹诺夫，亚历山大·拉多维奇莫雷诺，克里斯托弗·梅德，
申请(专利权)人：西北大学，埃克西奎雷股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US