pH梯度主动载药法制备的脂质体药物的体外释放测试方法技术

本发明专利技术涉及一种脂质体药物的测试方法，尤其涉及一种pH梯度主动载药法制备的脂质体药物的体外释放。本发明专利技术通过容器竖直位移运动方式控制促释剂释放化合物的速率，以及化合物在溶液和空气中的溶解平衡，间接地控制药物的释放速率，并模拟体内血液循环对药物的动力作用。通过控制促释剂的加入量、温度或转速等参数，可精确调节释放速率。该方法可控性高，操作方便，重复性好。还可加入离子交换树脂吸附释放出的游离药物，起到模拟体内漏槽状态的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脂质体药物的测试方法，尤其涉及一种在体外模拟脂质体药物进入体内后的释药过程的测试方法。
技术介绍
自20世纪90年代磷脂双层膜发现以来，脂质体作为药物递送载体的研究获得了长足发展。脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。磷脂分子在水中将分子亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空气，形成具有脂质双层结构的球形脂质体，粒径通常为25～1000nm。脂质体的双层膜结构类似于生物膜，具有良好的生物相容性；经脂质体包裹的药物，具有靶向性、长效性、低毒性以及包封保护良好的优点。因此，脂质体被用于多种活性药物的递送，以改善药物进入体内后的血液循环时间，增加在靶部位的蓄积。通过改变粒子的粒径、脂质处方组成以及脂膜表面特征，可以改变脂质体的功能。使用不同脂质材料可以制备长循环脂质体、热敏脂质体、pH敏感脂质体、免疫脂质体等各种功能性脂质体，达到特殊治疗目的。因此，为了合理设计脂质体药物递送系统，就需要对药物在体内和体外的释放行为进行详细研究，通过体外模拟脂质体药物进入体内后的释药过程进行测试。然而，目前仅有的测试方法都有严重不足之处。以阿霉素脂质体为例，FDA指南中的体外释放考察方法仅仅给出了介质pH和温度这两个实验参数，通过大体积缓冲液或含有人血浆的缓冲液模拟体内生理环境。但由于阿霉素在脂质体内以硫酸阿霉素的沉淀形态存在，溶解度很低，导致释放速率太慢，难以满足质量控制体系中快速评估的要求。AviSchroeder和YechezkelBarenholz采用的低频超声法(LFUS)能在短时间(3分钟)内释放80％的药物，但低频超声会导致脂质膜瞬态孔样缺陷，对脂质体的破坏剧烈，释放中的脂质体已无制剂概念，无法模拟体内生理环境。AtsukoHioki和YoshieMaitani采用在高温(50℃)条件下，加入牛血清白蛋白(bovineserumalbumin(BSA))来加速药物释放。上述方法虽然能在较短时间内完成释放，但其释放曲线十分不稳定，重复性差，无法作为质量评价的标准。JingXiaCui等人在脂质体中加入氯化铵，然后放于52℃恒温孵育以考察阿霉素释放行为。其原理：氯化铵溶液在加热过程中会分解产生氨分子，同时在接近磷脂相变52℃的温度下，脂质体膜流动性提高，于是氨分子可以透过脂质膜进入脂质体内部，而后与硫酸阿霉素的阿霉素发生置换反应，置换出的游离阿霉素分子则透过脂膜，扩散到脂质体外部，从而达到阿霉素的释放。该过程中，原始脂质体内部的pH是偏低的，氨分子进入脂质体内部后会打破pH平衡，从而令药物释放。关于此方法的详细论述可参见文献：①JControlRelease,2007Apr2；118(2):204-15,Directcomparisonoftwopegylatedliposomaldoxorubicinformulations:IsAUCpredictivefortoxicityandefficacy；②Bioanalysis,2011Feb；3(3):333-44,InvitroandinvivocharacterizationsofPEGylatedliposomaldoxorubicin。此方法的理念来自于固体制剂溶出释放实验中加入促释剂促进药物释放，是公认的用于考察阿霉素脂质体的方法。然而在此方法中，阿霉素释放的主要推动力是氯化铵的加入量，如果要达到理想的阿霉素释放量，则需加入大量氯化铵。但同时，氯化铵的化学作用非常迅速，在短时间0.5h就能达到60％的释放，3h即达到平台期。因此，此方法所获得的释放曲线细节特征不明显，无法将阿霉素的主要释放期时间拉长，以增加不同制剂处方之间的区分性，也就无法模拟药物的体内体外释放关系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种释药速率可控性高、重复性好的脂质体药物体外释放的测试方法。一种pH梯度主动载药法制备的脂质体药物的体外释放测试方法，所述脂质体药物为溶液形态，溶解有包封了药物的脂质体颗粒，包含如下步骤：(1)在预设定的温度下，将所述脂质体药物与促释剂的混合溶液装入容器内，并将所述容器封闭，所述容器内还存在不超过其容积30％的空气；(2)令所述容器进行在竖直方向上存在来回位移的运动；(3)在所需时间点取样，并测定所述脂质体药物的未释放药物浓度或已释放药物浓度，计算药物的释放速率。进一步地，所述步骤(1)中预设定的温度为所述脂质体颗粒的磷脂相变温度±20摄氏度。进一步地，所述药物为蒽环类药物、长春新碱或两性霉素B，优选为阿霉素。进一步地，所述混合溶液中促释剂的浓度为5～100mM。所述混合溶液pH值为5.5-6.5。进一步地，所述步骤(2)中的所述运动为绕一非竖直的旋转轴旋转，且所述容器为条状，所述容器以径向垂直所述旋转轴的方式安装。更进一步地，所述步骤(2)的旋转运动利用分子杂交仪完成，所述旋转轴为水平，所述容器为离心管，所述转速为15～50rpm。进一步地，在所述步骤(1)中，向所述容器内加入预设量的用于吸附释放出的游离药物的离子交换树脂，所述的预设量不小于将所述脂质体药物内包封的所有药物全部吸附所需的量；所述步骤(3)中测定的是所述脂质体药物中的未释放药物浓度。更进一步地，所述离子交换树脂为阳离子交换树脂。与现有方法相比，本专利技术具有如下优点：(1)通过容器运动模拟体内血液循环对药物的动力作用，能更好地模拟药物进入体内后的释放行为，其释放过程更接近体内释放的真实情况。(2)所有操作参数，包括促释剂浓度、温度、转速等均可控，从而能方便地调节释放速率，无论是需要短时间快速释放，还是需要拉长主要释放期时间以增强多个释药曲线之间的区分性，均能方便地实现。(3)实验重复性远高于现有技术的各种方法，可靠性高。(4)若在容器内加入离子交换树脂，则可利用树脂对释放出来的游离药物进行即时吸附，起到模拟体内漏槽状态的效果，并能快速测定残留的未释放药物浓度，大大提高实验效率。综上所述，本专利技术是目前唯一能满足药品生产质量评价体系要求的测试方法。附图说明图1：静置、搅拌、旋转三种不同运动方式下的释放行为对比图；图2：实施例2中每个时间点的6支样品释放速率曲线对比图；图3：温度及PBS缓冲液的pH值对释放速率的影响；图4：实施例12中不同氯化铵浓度下阿霉素的释放速率对比图；图5：实施例14中不同处方脂质体的释放速率对比图；图6：实施例14中3ml加液量下各组样品的释放速率对比图；图7：实施例15中4ml加液量下各组样品的释放速率对比图。具体实施方式本专利公开的测试方法适用于所有利用pH梯度主动载药法制备的脂质体，如阿霉素脂质体、长春新碱脂质体等。本专利中，促释剂定义是广义上包括了所有能促进脂质体药物释放的物质，其包括表面活性剂，或能在溶液中释放出氨分子的化合物，如硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、乙醇胺、二乙胺、乙二胺等。凡是能够在水溶液中分解出能进入脂质体内部并打破保持药物在脂质体内部稳定存在的pH梯度的化合物都可以使用。促释剂的加入量是重要的控制参数之一。以氯化铵为例，其在溶液中的浓度越低，释放出的氨分子就越少，混合溶液中脂质体药物能接触到的氨分子也越少，则释放速率会降低。同时，促释剂的加入量也与其种类有关。例如，醋酸铵相对于氯化铵属于弱电解质，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种pH梯度主动载药法制备的脂质体药物的体外释放测试方法，所述脂质体药物为溶液形态，溶解有包封了药物的脂质体颗粒包含如下步骤：(1)在预设定的温度下，将所述脂质体药物与促释剂的混合溶液装入容器内，并将所述容器封闭，所述容器内还存在不超过其容积30％的空气；(2)令所述容器进行在竖直方向上存在来回位移的运动；(3)在所需时间点取样，并测定所述脂质体药物的未释放药物浓度或已释放药物浓度，计算药物的释放速率。

【技术特征摘要】
1.一种pH梯度主动载药法制备的脂质体药物的体外释放测试方法，所述脂质体药物为溶液形态，溶解有包封了药物的脂质体颗粒包含如下步骤：(1)在预设定的温度下，将所述脂质体药物与促释剂的混合溶液装入容器内，并将所述容器封闭，所述容器内还存在不超过其容积30％的空气；(2)令所述容器进行在竖直方向上存在来回位移的运动；(3)在所需时间点取样，并测定所述脂质体药物的未释放药物浓度或已释放药物浓度，计算药物的释放速率。2.如权利要求1所述的体外释放测试方法，其特征在于步骤(1)中预设定的温度为所述脂质体颗粒的磷脂相变温度±20摄氏度。3.如权利要求1所述的体外释放测试方法，其特征在于步骤(1)中所述混合溶液中所述脂质体药物与促释剂的质量摩尔比范围为1:(0.1～5)。4.如权利要求1所述的体外释放测试方法，其特征在于步骤(1)中所述混合溶液中促释剂的浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐海玲，张金平，毛文学，苏勇，
申请(专利权)人：上海复旦张江生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31