本发明专利技术涉及一种用于口服蛋白免疫的纳米混悬剂及其制备方法，属于医药领域。以牛血清白蛋白(BSA)为模型药物，以PLGA为载体，采用溶剂挥发法制备载有BSA的MCS/PLGA/BSA纳米混悬剂。粒径为532.8nm，ζ电位为28.92mv，包封率为89.34％。甘露糖化壳聚糖(MCS)通过静电作用吸附在PLGA/BSA纳米粒表面，不仅提高了纳米粒在胃肠液中的稳定性，还延长了纳米粒在肠腔的滞留时间，而且带正电的纳米粒更容易被细胞摄取。纳米粒利用滤泡相关上皮对纳米粒的转运作用转移至PP结，通过甘露糖配体与抗原呈递细胞(APCs)上的甘露糖受体结合，增加APCs摄取，从而诱导免疫反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于口服蛋白免疫的纳米混悬剂及其制备方法，属于医药领域。
技术介绍
疫苗是预防感染性疾病最有效的方法之一。黏膜暴露在大量的共生菌和病原微生物中，是感染发生的首要区域，而且在一个健康成年人体内，黏膜相关淋巴组织(MALT)占了所有免疫细胞的80％，是最大的哺乳动物淋巴系统。然而，绝大多数的上市疫苗均为肌注疫苗，肌注免疫虽然能产生强效的全身免疫反应，但是不能在黏膜部位诱导强效的免疫反应。因此，与注射疫苗相比，黏膜疫苗有着诸多优势，包括诱导有效的粘膜免疫反应及全身免疫反应，产生黏膜IgA和血清IgG抗体，避免疼痛，降低注射感染的风险。此外，抗原在某一黏膜部位给药不仅能在该部位诱导产生局部黏膜免疫反应，而且能在较远黏膜部位产生免疫反应，这些都使得黏膜成为疫苗免疫的理想位点。虽然鼻腔、直肠及阴道给药都能诱导黏膜免疫反应，但是它们不足以对抗肠道感染，而且给药不方便。相反，疫苗口服能产生有效的局部粘膜免疫并增加病人顺应性，而且不需要专业训练。1960年出现的第一个口服疫苗-Sabin脊髓灰质炎疫苗，首次引入了口服黏膜免疫接种的概念。目前，研究人员开发了许多用于口服免疫的疫苗，包括预防霍乱和伤寒的细菌疫苗以及轮状病毒感染的病毒疫苗。虽然这些减活或灭活的细菌或病毒能诱导体液及细胞免疫，但是它们自身存在稳定性和安全性问题。现代疫苗学的重心是研发由纯化的亚单位，例如多肽、蛋白抗原组成的疫苗。然而，这类抗原口服很难吸收，主要是因为它们黏膜渗透性差，而且在胃肠道内不稳定。它们的免疫原性甚至比传统疫苗还低。为了解决蛋白疫苗在胃肠道不稳定的问题，研究人员开发了一系列的聚合物载体系统。从药剂角度来看，聚合物载体系统有着特别之处。首先，它们在胃肠道内比其它的胶体载体，例如脂质体，更加稳定，能保护被包封的药物不受胃肠道环境干扰。其次，各种聚合物材料的使用对理化性质(疏水性、ζ电位)、药物释放性质(推迟、延长、触发)及纳米粒的释放行为(靶向、生物粘附、细胞摄取提高)进行修饰、调整。最后，可以通过微粒表面吸附或化学连接特定分子例如PEG(聚乙二醇)，泊洛沙姆及生物活性物质(凝集素、侵袭素)等进行修饰。此外，与更大的载体相比，它们亚微米的粒径及较大的比表面积都支持它们的吸附。所以，多肽和蛋白经纳米包裹后能对抗胃肠道内的恶劣环境，并增强它们跨黏膜转运。PLGA具有可生物降解性和生物相容性，降解产物无毒，无致畸、无致癌性，已列入FDA GRAS安全化合物。PLGA包裹蛋白抗原后能保护蛋白抗原免受胃肠道内恶劣环境及各种酶的破坏。然而肠腔内杯状细胞分泌大量粘液覆盖在肠上皮细胞表面，粘液层作为一个复杂而又强效的屏障，通过快速
清除外源微粒来保护肠上皮细胞表面。因此，肠细胞表面的粘液层严重影响了上皮细胞对疏水性纳米粒的摄取。PLGA表面疏水，不易渗透进入粘液层，很难被肠上皮细胞摄取。壳聚糖(chitosan，CS)是一种阳离子聚合物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，有利于纳米粒粘附在细胞表面，并具有打开肠上皮细胞间紧密连接的能力。CS通过静电作用吸附在PLGA纳米粒表面，不仅可以增加载体的亲水性，促进PLGA纳米粒渗透进入粘液层，增加细胞摄取，而且可以通过激活树突状细胞、巨噬细胞来增强免疫反应。有研究表明滤泡相关上皮(FAE)上存在甘露糖受体，纳米粒表面的甘露糖配体与受体的结合促进了FAE对纳米粒的转运。而且巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞(APCs)表面大量表达甘露糖受体，进入Peyer’s patches(PPs)内的纳米粒通过糖类识别机制，借助受体介导的APCs主动靶向，增加APCs对疫苗的摄取，提高疫苗的免疫原性，从而增强免疫反应。
技术实现思路
本专利技术针对蛋白疫苗口服后易失活、疗效差，且肌注疫苗无法诱导产生黏膜免疫反应等问题，设计了一种用于口服蛋白免疫的纳米混悬剂，利用FAE对纳米粒的转运作用，将载有蛋白抗原的纳米粒运送至巨噬细胞、树突状细胞等APCs附近，借助受体介导的APCs主动靶向，增加APCs对疫苗的摄取，从而诱导免疫反应。本专利技术提供了CS/PLGA/BSA纳米混悬剂及其制备方法，具体制备过程是：(1)将PLGA溶解于适量二氯甲烷中，作为油相；(2)将蛋白药物BSA加入去离子水中，使其缓慢溶胀，然后磁力搅拌至完全溶解，作为内水相；(3)将甘露糖化壳聚糖(MCS)溶于0.5％的醋酸溶液中，使其缓慢溶胀，然后磁力搅拌至完全溶解，再用氢氧化钠溶液将其pH调至5.5左右；(4)将泊洛沙姆188加入去离子水中，使其缓慢溶胀，然后磁力搅拌至完全溶解；(5)将MCS溶液与泊洛沙姆188溶液按一定体积比混合，作为外水相；(6)将内水相加至油相中，在冰浴条件下，探头超声一段时间，得到水/油初乳；(7)将油包水初乳加至外水相中，在冰浴条件下，探头超声一段时间，得到水/油/水复乳；(8)将复乳加至稀释液中，冰浴条件下，磁力搅拌过夜，即得MCS/PLGA/BSA纳米混悬剂。本专利技术制备过程(1)中，PLGA为羧基末端，分子量为15000，乳酸与羟基乙酸的比例为75∶25。本专利技术制备过程(2)中，所选择的药物仅为模型药物BSA，但不局限于此，药物还可以是用于预防小儿麻痹症、流感等疾病的蛋白疫苗。本专利技术制备过程(3)中，MCS分子量为115 kDa，脱乙酰基度＞95％，甘露糖取代度11.2％；MCS溶液浓度在0.125mg/ml～4mg/ml，优选2mg/ml。本专利技术制备过程(5)中，MCS溶液为1mL，泊洛沙姆188溶液为4mL；外水相中泊洛沙姆浓度在0.1％～5％，优选1％。处方中BSA与PLGA的质量比在1∶1～1∶10，优选1∶4；PLGA浓度在5mg/mL～80mg/mL，优选40mg/mL；处方中内水相、油相和外水相的体积比为0.25∶1∶5。本专利技术制备过程(6)中，初乳超声功率为70～500W，优选为300W，初乳超声时间为9s(工作时间1s，休息时间2s)。本专利技术制备过程(7)中，复乳超声功率为70～500W，优选为150W，复乳超声时间为为6s～60s，优选为15s(工作时间1s，休息时间2s)。本专利技术制备过程(8)中，稀释液是0.1％泊洛沙姆188溶液，体积为20ml。本专利技术制备过程(6)、(7)、(8)中均采用冰浴条件。本专利技术的优点在于：1)PLGA对药物的包封率普遍较低，而药物损失率较高。本专利技术采用溶剂挥发法，进行两次探头超声，探头超声可以使PLGA纳米粒粒径分布更加均匀。在超声及溶剂挥发步骤中均采用冰浴条件，低温不仅可以保护蛋白药物结构，还可以明显提高药物包封率。2)本专利技术采用MCS包裹PLGA/BSA纳米粒，MCS通过静电作用吸附在PLGA/BSA纳米粒表面，不仅提高了纳米粒在胃肠液中的稳定性，还延长了纳米粒在肠腔的滞留时间，而且带正电的纳米粒更容易被上皮细胞摄取。纳米粒表面的甘露糖配体与FAE表面的甘露糖受体之间的相互作用促进了纳米粒的转运，转运至PPs内部的纳米粒借助受体介导的APCs主动靶向，增加APCs对纳米粒的摄取，从而诱导免疫反应。3)本专利技术的制备方法对仪器设备要求不高，工艺过程简单，可进行放大工业化生产，具有良好的应用前景。具体实施方式实施例1：PLGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于口服蛋白免疫的纳米混悬剂及其制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将PLGA溶解于适量二氯甲烷中，作为油相；(2)将蛋白药物BSA加入去离子水中，使其缓慢溶胀，然后磁力搅拌至完全溶解，作为内水相；(3)将甘露糖化壳聚糖(MCS)溶于0.5％的醋酸溶液中，使其缓慢溶胀，然后磁力搅拌至完全溶解，再用氢氧化钠溶液将其pH调至5.5左右；(4)将泊洛沙姆188加入去离子水中，使其缓慢溶胀，然后磁力搅拌至完全溶解；(5)将MCS溶液与泊洛沙姆188溶液按一定体积比混合，作为外水相；(6)将内水相加至油相中，在冰浴条件下，探头超声一段时间，得到水/油初乳；(7)将油包水初乳加至外水相中，在冰浴条件下，探头超声一段时间，得到水/油/水复乳；(8)将复乳加至稀释液中，冰浴条件下，磁力搅拌过夜，即得MCS/PLGA/BSA纳米混悬剂。
【技术特征摘要】
1.一种用于口服蛋白免疫的纳米混悬剂及其制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将PLGA溶解于适量二氯甲烷中，作为油相；(2)将蛋白药物BSA加入去离子水中，使其缓慢溶胀，然后磁力搅拌至完全溶解，作为内水相；(3)将甘露糖化壳聚糖(MCS)溶于0.5％的醋酸溶液中，使其缓慢溶胀，然后磁力搅拌至完全溶解，再用氢氧化钠溶液将其pH调至5.5左右；(4)将泊洛沙姆188加入去离子水中，使其缓慢溶胀，然后磁力搅拌至完全溶解；(5)将MCS溶液与泊洛沙姆188溶液按一定体积比混合，作为外水相；(6)将内水相加至油相中，在冰浴条件下，探头超声一段时间，得到水/油初乳；(7)将油包水初乳加至外水相中，在冰浴条件下，探头超声一段时间，得到水/油/水复乳；(8)将复乳加至稀释液中，冰浴条件下，磁力搅拌过夜，即得MCS/PLGA/BSA纳米混悬剂。2.根据权利要求1所述一种用于口服蛋白免疫的纳米混悬剂及其制备方法，其特征在于：步骤(1)中PLGA为羧基末端，分子量为15000，乳酸与羟基乙酸的比例为75∶25。3.根据权利要求1所述一种用于口服蛋白免疫的纳米混悬剂及其制备方法，其特征在于：步骤(2)中所选择的药物仅为模型药物BSA，但不局限于此，药物还可以是用于预防小儿麻痹症、流感等疾病的蛋白疫苗。4.根据权利要求1所述一种用于口服蛋白免疫的纳米混悬剂及其制备方法，其特征在于：步骤(3)中MCS分子量为115kDa，脱乙酰基度＞9...
【专利技术属性】
技术研发人员：王柏，迟环，宗莉，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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