本发明专利技术涉及一种大豆磷脂酶D基因，属于生物技术领域，涉及到改变经济作物种子品质和产量的基因工程领域，属于大豆磷脂酶D基因序列及应用。本发明专利技术中大豆磷脂酶D基因序列如SEQ ID NO.1所述，克隆该基因并在拟南芥中过表达。方法步骤如下：PCR克隆大豆大豆磷脂酶D基因序列，将扩增片段引入到super1300超表达载体，酶切鉴定后测序以验证正确，蘸花法转化拟南芥，获得纯合体，测定种子中油脂含量。本发明专利技术分离得到的大豆磷脂酶D基因对植物种子中油脂含量有显著提高作用。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及到基因工程领域，特别涉及到大豆中磷脂酶D基因的序列及其应用。具体而言，本专利技术是克隆大豆磷脂酶D基因并构建过表达载体，转化植物，使转化宿主种子中油脂含量升高的方法与应用。(二)
技术介绍
植物体内的油脂在植物生长，发育和繁殖过程中起着重要作用。油脂是人类的重要食物之一，也是重要的化工原料，用于制造肥皂、脂肪酸、甘油、油漆、乳化剂、润滑剂等，还用于医药、化妆品制造；并且有可能作为生物燃料的重要原料。重大需求极大地促进了对植物油脂的研究，目前已在在阐明其代谢途径、基因克隆、功能分析，以及利用基因工程改良植物油脂品质等方面取得了较大的进展。大豆是世界上植物油和植物蛋白质的重要来源。随着人们生活水平的不断提高，工业需求的不断增加，对大豆产量和品质的要求越来越高。利用基因工程技术进行大豆高油育种，成为研究热点。磷脂酶D(phospholipase D，PLD)在植物和动物生长发育中都起着很重要的作用，在很多种高等植物中PLD已经被报道，包括拟南芥、水稻、白杨、葡萄、大豆等，按照酶活对Ca2+的依赖性可分为C2-PLD、PX/PH-PLD和SP-PLD，根据进化关系和生化活性可主要分为7个类型α、β、γ、δ、ε、ζ和前五个类型属于C2-PLD，后面两个类型分别属于PX/PH-PLD和SP-PLD(Qing and Wang，2002；Li et al.，2007)。在动物有3个PLD，分别为PLD1、PLD2和mtPLD，前两者是PX/PH-PLD，最后一个是定位于线粒体并主要水解心磷脂的PLD(其他类型PLD主要水解细胞膜上的磷脂如磷脂酰胆碱等)(Choi et al.，2006；Kanaho et al.，2009)。磷脂酶D(phospholipase D，PLD)能水解磷脂包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸等，产生PA和一个水溶性头部，而PA在植物生长发育和抗逆反应中都起着很重要的作用(Li et al.，2009)。在植物中PLD研究比较多的是拟南芥和水稻，拟南芥中PLDα1参与ABA调控的气孔关闭，同时也参与MAP65-1相关的盐胁迫(Zhang et al.，2004；Zhang et al.，2012)；PLDα3参与拟南芥渗透胁迫和盐胁迫(Hong et al.，2008)；PLDδ参与拟南芥冷冻伤害和ABA调节的气孔关闭(Zhang et al.，2003)；PLDζ参与磷缺乏的逆境反应和根毛的生长。在水稻中PLDβ1参与抗病反应，水稻PLDβ1干扰突变体，会产生更多的ROS来抵抗病原菌的侵染(Li et al.，2007；Wang et al.，2000；Yamaguchi et al.，2009)。在动物中，PLD被发现在细胞活动和发育中也有很多重要的功能，如膜转运、分泌、细胞内吞、细胞生长、细胞分化和骨架的重排等(Cockcroft，2001)。显而易见，PLD参与了动植物生长发育过程中许多重要活动，但是PLD调控植物油脂合成的功能报道甚少。目前，随着技术的进步，国内外已经从植物体内或外源获得了多种提高油脂含量的基因，但是发现更多调控植物油脂合成的基因将会更加有助于农业生产的发展。(三)
技术实现思路
本专利技术通过PCR克隆技术分离到提高植物种子中油脂合成的基因，更具体的是大豆中提高植物种子中油脂合成的基因，所述基因为大豆Williams 82第1号染色体上Gm01g42420基因。本专利技术提供了一种大豆中分离的多核苷酸，包含或由选自下组之一的多核苷酸组成：a)具有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸；b)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或编码在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO：2所示的cDNA序列，或具有SEQ IDNO：3所示的序列；本专利技术的多核苷酸是一种提高植物种子油脂含量的核酸。本专利技术还提供了一种核酸构建体，其包含上述至少一种多核苷酸。本专利技术还提供了一种植物细胞，其包含上述至少一种多核苷酸。本专利技术还提供了包含上述植物细胞的植物，所述植物为双子叶植物。本专利技术还包括植物材料，其包括本专利技术的植物的后代，克隆，繁殖材料，种子，荚果。优选地，本专利技术的植物材料是种子。本专利技术还包括从本专利技术的植物材料制备的组合物，包括食品，油，粉，饲料本专利技术还包括从经转化的植物的一或多种种子制备的油，所述植物含有本专利技术的多核苷酸。本专利技术提供一种蛋白质，其具有SEQID NO：4所示的氨基酸序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列。本专利技术提供一种促进种子油脂合成的方法，包括在产生所述种子并且含有本专利技术的多核苷酸的植物中使本专利技术的多核苷酸表达升高的步骤。本领域普通技术人员了解使本专利技术的多核苷酸表达升高的方法。通过本专利技术人的研究，本领域技术人员可以相信，通过用本专利技术的多核苷酸转化目标植物，并使所述多核苷酸在目标植物中表达，特别是过表达，可以促进油脂合成正调控，从而提促进种子中油脂合成，进而提高种子中的油脂含量。所述方法对于希望其中油脂含量尽可能高的种子，具有重要意义。转化植物并使本专利技术的多核苷酸在被转化的植物中表达的方法是本领域普通技术人员所熟知的。本专利技术的另一个目的是提供本专利技术的多核苷酸在控制种子油脂合成中的用途。本专利技术的其它目的见于本专利技术的详细描述之中。(四)附图说明图1本专利技术中用到的相关表达载体构建的酶切鉴定(载体构建酶切验证。A.转基因过表达载体B.带GFP标签永久过表达载体C.原核表达载体)。图2本专利技术的大豆磷脂酶D的表达与活性测定(大豆磷脂酶D活性测定)。图3本专利技术的大豆磷脂酶D的亚细胞定位(大豆磷脂酶D亚细胞定位)。图4野生型、空转对照、大豆磷脂酶D过表达株系种子的油脂含量与脂肪酸组分含量(油脂含量及脂肪酸组分含量)。图5野生型、空转对照、大豆磷脂酶D过表达株系种子的千粒重(千粒重)。(五)具体实施方案一、大豆及拟南芥的培养大豆种子直接播撒在营养土和蛭石(1∶3)中，每隔一周换Hogland营养液，25℃，光照条件为16/8。拟南芥种子先用75％乙醇消毒3min，灭菌水洗两次，用2％NaClO灭菌5-10min，灭菌水洗4次，然后种在MS培养基上；4℃黑暗处理两天，移到23℃(12h，白天)/20℃(12h，黑夜)光照培养箱放置7天；将7天的幼苗移到蛭石和营养土(3∶1)混合物中；生长条件是24℃(16h，白天)/22℃(8h，黑夜)、100μmol photons m-2s-1光照强度、60％相对湿度；待生长开花开始侵染转基因。二、大豆磷脂酶D基因的克隆及过表达载体构建1.提取大豆植株组织RNA取适量上述大豆组织样品，研磨充分，期间不断加入液氮，直至样品成粉状；转移样品至装有适量RNAiso Plus的1.5mltube中，室温静置5分钟，12000g4℃离心5分钟，转移上清至新的1.5mltube中，加入1/5RNAiso Plus体积量的氯仿，振荡混匀，室温静置5分钟，12000g4℃离心15分钟，转移上清至新的1.5mltube中，加入0.5-1倍RNAiso Plus体积量的异丙醇，室温静置10分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大豆来源的磷脂酶D基因，其包含或由选自下组之一的多核苷酸组成：a)具有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸；b)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或编码在SEQID NO：4所示的氨基酸序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO：2所示的cDNA序列，或具有SEQ IDNO：3所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种大豆来源的磷脂酶D基因，其包含或由选自下组之一的多核苷酸组成：a)具有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸；b)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或编码在SEQID NO：4所示的氨基酸序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO：2所示的cDNA序列，或具有SEQ IDNO：3所示的序列。2.含有权利要求1所述核...
【专利技术属性】
技术研发人员：章文华，柏杨，赵江哲，井文，井广琴，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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