本发明专利技术公开了两种用于酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物相关靶点蛋白活性检测的抗体芯片，包括基于基片的固相抗体芯片以及基于微珠的液态悬浮芯片，该抗体芯片所包含的检测指标涵盖了目前已上市的酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的相关靶点。本发明专利技术还公开了四种运用该抗体芯片的检测方法，包括基于样本标记的单色荧光检测法、基于样本标记的双色荧光检测法、双抗夹心检测法以及利用液相悬浮芯片检测的方法。运用本发明专利技术对肿瘤患者手术切除样本进行检测，实现个性化有效治疗的用药指导。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生化医药
，尤其涉及酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物个性化治疗指导的药物靶点蛋白活性检测的抗体芯片和检测方法。
技术介绍
蛋白酪氨酸激酶(PTKs，protein tyrosine kinases)或酪氨酸激酶(TKs，tyrosine kinases)，特异地将蛋白质底物上的某些酪氨酸残基磷酸化，从而调节其功能的酶。可分为三类：①受体酪氨酸激酶，为单次跨膜蛋白；②胞质酪氨酸激酶，如Src家族、Tec家族、ZAP70家族、JAK家族等；③核内酪氨酸激酶，如Abl和Wee。根据PTK是否是细胞膜受体，分成受体型和非受体型。受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是激酶，能够与配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶活性的细胞内结构域。主要有表皮生长因子(EGF)受体，包括EGFR、HER2、ErbB4等成员；血小板生长因子(PDGF)受体和集落刺激因子1(CSF-1)受体，包括PDGFRA、PDGFRB、CSF1R、KIT等成员；胰岛素和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)受体，包括IGF1R等成员；神经生长因子(NGF)受体、成纤维细胞生长因子(FGF)受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体和肝细胞生长因子(HGF)受体，包括VEGFR1(FLT-1)、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT-4)等成员。迄今发现的蛋白酪氨酸激酶中多数是属于致癌RNA病毒的癌基因产物，也可由脊椎动物的原癌基因产生。超过50％的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，调节正常细胞的信号传递和发育，也与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和凋亡密切相关。PTK功能的失调会导致其下游信号通路的激活，进而引起细胞增殖调节紊乱，导致肿瘤的形成。因此，以PTK为靶点的药物研发已经成为当前抗肿瘤药物研究的热点之一。目前主要有两种途径可以终止酪氨酸激酶所介导的信号转导通路，一类是单克隆抗体，如曲妥珠单抗(Trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)；另一类是酪氨酸激酶抑制剂类(TyrosineKinase Inhibitors，TKIs)小分子药物。已经批准上市的TKI类抗肿瘤药物包括伊马替尼(Imatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、索拉非尼(Sorafenib)、达沙替尼
(Dasatinib)、舒尼替尼(Sunitinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、鲁索利替尼(Ruxolitinib)、克唑替尼(Crizotinib)、维罗非尼(Vemurafenib)、凡德他尼(Vandetanib)、埃克替尼(Icotinib)、普纳替尼(Ponatinib)、卡波替尼(Cabozantinib)、瑞格非尼(Regorafenib)、伯舒替尼(Bosutinib)、阿西替尼(Axitinib)、拉多替尼(Radotinib)、阿法替尼(Afatinib)、曲美替尼(Trametinib)、达拉菲尼(Dabrafenib)、依鲁替尼(Ibrutinib)共24种，见表1，包括各自药物作用的靶点。恒瑞医药的重磅新药阿帕替尼(Apatinib)可抑制VEGFR酪氨酸激酶活性，阻断VEGF结合后的信号传导，导致肿瘤血管生成抑制。这是由中国肿瘤专家团队与民族制药企业历经10年，共同创新研发的全球第一个小分子抗血管生成靶向药物，该药物第一次在晚期胃癌被证实有确切疗效和安全性。目前进入三合一综合审评，获批进入倒计时。表1目前上市的TKIs抗肿瘤药物[1][1]，作用靶点查询自DrugBank(http：//www.drugbank.ca/)与Therapeutic target database(http：//bidd.nus.edu.sg/group/TTD/ttd.asp)。TKI类靶向药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后的药效个体差异很大。大量的临床研究已经证实，TKIs的疗效/毒副作用与患者体内某些酪氨酸激酶的活性直接相关，见表1。因此，在患者接受抗肿瘤药物之前，对这些酪氨酸激酶的活性进行鉴定将有助于临床医生判别患者是否适合使用此类药物，减少药物毒副作用的发生，同时避免医疗资源的浪费。同时，肿瘤作为一种复杂的疾病，其生长和存活不仅仅依赖于一种受体或信号通路，这使得作用于单一靶点的药物不能完全杀灭肿瘤细胞。研究表明不同靶点药物的联合使用能够抑制多个信号转导通路，诱导肿瘤细胞的凋亡，阻断新生血管的生成，抑制肿瘤细胞的增殖。因此，在患者接受抗肿瘤药物之前，对这些酪氨酸激酶的活性进行鉴定也有助于医生判别是否需要联合用药。目前，影响酪氨酸激酶的活性包括其表达水平以及修饰水平的检测主要基于免疫印迹法(Western blot，WB)。然而WB法耗时、费力，难以同时进行批量蛋白的检测，不适合用于临床应用。尽管有些药物是针对靶点的突变而设计，然而这些突变归根结底也是模拟活性位点的修饰，或者促进活性位点的修饰。因此，迫切需要一种能同时检测酪氨酸激酶表达与修饰水平的高通量技术。抗体芯片技术与基因芯片类似，利用抗原抗体结合的原理，在基片上将相应的抗体按照一定的规则固定排列，具备高通量的特点。尽管Full Moon、RayBio、R&D、CST、Merck公司拥有用于科研的类似产品，但所包含的检测指标只包括少量的TKI类抗肿瘤药物的作用靶点，产品并不聚焦于TKI类作用靶点，且基本不包括修饰位点的检测，难以应用于临床(表2)。表2目前市场上类似的产品
技术实现思路
本专利技术提供了用于个性化治疗指导的酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的相关靶点蛋白活性检测的抗体芯片以及检测方法。该抗体芯片利用抗原抗体结合的原理，可用于检测目前已上市的抗肿瘤药物相关靶点的蛋白活性，即以下46种药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平：Bcr-Abl、ABL1、ABL2、ALK、BTK、CSF1R、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、ERBB2、ERBB3、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT1、FLT3、FLT4、FRK、FYN、HCK、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、KDR、KIT、LCK、LYN、MET、NTRK1、PDGFRA、PDGFRB、PTK6、RET、SRC、TEK、YES1、BRAF、RAF1、MAPK11、MAP2K1、MAP2K2、MAP3K2(包含6种丝氨酸/苏氨酸激酶，见表3)。表3本专利技术所包含的检测指标为了实现上述目的，本专利技术所采用的一种技术方案是：采用固相抗体芯片，即通过芯片点样仪将上述检测指标对应的各自抗体点制在基片上，每种抗体设置重复。点制的内参抗体为β-actin、α-tubulin以及GAPDH等。选择荧光基团作为阳性对照，点样缓冲液作为阴性对照(表4)。优先地，所述抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
两种用于酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物相关靶点蛋白活性检测的抗体芯片，其特征在于，所述抗体芯片包括基于基片的固相抗体芯片以及基于微珠的液态悬浮芯片。
【技术特征摘要】
1.两种用于酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物相关靶点蛋白活性检测的抗体芯片，其特征在于，所述抗体芯片包括基于基片的固相抗体芯片以及基于微珠的液态悬浮芯片。2.根据权利要求1所述的抗体芯片，其特征在于，所述基片包括：醛基、环氧树脂、聚糖或其他高分子修饰的玻片式或膜式基片。3.根据权利要求1所述的抗体芯片，其特征在于，所述抗体芯片包括的检测指标涵盖了目前已上市的酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的相关靶点，即46种药物相关靶点蛋白的表达水平和(或)修饰水平。4.根据权利要求3所述的抗体芯片，其特征在于，所述46种药物相关靶点蛋白包含：Bcr-Ab1、ABL1、ABL2、ALK、BTK、CSF1R、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT1、FLT3、FLT4、FRK、FYN、HCK、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、KDR、KIT、LCK、LYN、MET、NTRK1、PDGFRA、PDGFRB、PTK6、RET、SRC、TEK、YES1、BRAF、RAF1、MAPK11、MAP2K1、MAP2K2、MAP3K2。5.根据权利要求3所述的抗体芯片，其特征在于，所述抗体芯...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋凯，程磊，张庆华，
申请(专利权)人：上海华盈生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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