本发明专利技术涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了用于检测厄洛替尼和吉非替尼靶向用药相关基因突变的方法及其引物。本发明专利技术对EGFRmutT790M、EGFRmutL858R、EGFRmutdel、Krasmut这4个基因的突变位点相关核酸序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定位点经过多重PCR扩增后，最后以Ion?Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明专利技术的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快的优点。为厄洛替尼和吉非替尼靶向用药的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为筛选敏感个体的以及个性化用药提供理论基础。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及分子生物学基因
和医学领域，具体公开了用于检测厄洛替尼和吉非替尼靶向用药相关基因突变的方法及其引物。本专利技术对EGFRmutT790M、EGFRmutL858R、EGFRmutdel、Krasmut这4个基因的突变位点相关核酸序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定位点经过多重PCR扩增后，最后以Ion?Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本专利技术的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快的优点。为厄洛替尼和吉非替尼靶向用药的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为筛选敏感个体的以及个性化用药提供理论基础。【专利说明】厄洛替尼、吉非替尼靶向用药基因的检测方法及其引物
本专利技术涉及分子生物学基因
和医学领域，涉及用分子生物学方法对靶向用药基因突变位点检测的引物，特别涉及用1n Torrent半导体芯片测序技术对厄洛替尼、吉非替尼靶向用药基因突变进行定性、定量检测的相关引物及其试剂盒。
技术介绍
肺癌是一种高发病率的恶性肿瘤，其发病危险因素包括:吸烟、油烟暴露、饮食习惯、肺部疾病史和肺癌家族史等。非小细胞肺癌占肺癌病理分型的70~80%，恶性程度高，化疗为主要治疗手段。肿瘤的分子靶向治疗是以肿瘤细胞中所具有的特异性分子作为靶点，利用分子靶向药物特异性阻断该靶点的生物学功能，从而从分子水平逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为，达到抑制肿瘤的目的。表皮生长因子受体是一种跨膜受体，表皮生长因子结合于胞外结构域，形成受体二聚体，并激活胞内酪氨酸结构域，引发激酶自磷酸化和下游分子的磷酸化，激活包括增殖和存活在内的多种细胞功能。厄洛替尼(Erlotinib,商品名:特罗凯)和吉非替尼(Gefitinib,商品名:易瑞沙)是一类小分子的表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂，用于晚期非小细胞肺癌的治疗，其通过阻断细胞内酪氨酸激酶受体，抑制EGFR胞内区的酪氨酸激酶磷酸化，阻断EGFR信号通路而发挥抗肿瘤作用。EGFR基因突变多见于外显子19区的缺失突变，及20区和21区的点突变。外显子19碱基缺失主要是第746~752位密码子的碱基缺失突变，导致EGFR蛋白中氨基酸序列缺失，从而改变了受体ATP结合囊的角度，显著增强肿瘤细胞对厄洛替尼和吉非替尼的敏感性；外显子20的点突变主要是第790位密码子出现C — T转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由苏氨酸转变为甲硫氨酸(T790M)，这一突变仅见于药物治疗后复发者，突变使肿瘤细胞对厄洛替尼和吉非替尼产生抗性；外显子21的点突变主要是第851位密码子出现T — G转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸(L858R)，此处突变位于DGF序列附近，其作用是使EGFR酪氨酸激酶功能区中羧基端小叶的活化环稳定性提高，肿瘤细胞对厄洛替尼和吉非替尼的敏感性明显增强。K-ras是EGFR传导通路中的下游信号分子，该基因突变或过度表达后成为致癌基因。K-ras基因突变主要是密码子12、13、61位的鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代，结果导致甘氨酸被半胱氨酸或缬氨酸取代，增大了空间位阻。K-ras突变常见于晚期非小细胞肺癌，并与表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂获得性耐药有关。此外，在非小细胞肺癌患者中，K-ras突变与EGFR突变不同时出现，提示其可作为肿瘤对表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂不敏感的指标，这部分患者应采用其他方式治疗。通过检测EGFRmutT790M、EGFRmutL858R、EGFRmutdel、Krasmut 这 4 个基因的突变碱基，可以判断非小细胞肺癌患者个体对厄洛 替尼和吉非替尼的敏感性，筛选靶向治疗的最适合人群，从而避免了因为不合理用药而引起不必要的不良反应和经济损失。目前，已报道的用于厄洛替尼和吉非替尼靶向用药相关基因突变的方法主要包括传统的Sanger法和二代测序技术等，这些方法普遍存在技术流程复杂、周期长、成本高等缺点，使应用受到一定限制。1n Torrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H+,H+在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。1n Torrent半导体芯片测序技术与传统Sanger法及二代测序技术比较，1nTorrent技术有以下优势:系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对H+的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成IG通量的测序检测仅需2~3小时，是传统Sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。目前尚没有报道1nTorrent半导体芯片测序技术专门用于检测厄洛替尼和吉非替尼靶向用药相关基因突变的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的 是为了弥补现有技术的不足，提供针对厄洛替尼和吉非替尼靶向用药相关基因突变进行定性、定量检测的方法及其引物。为解决上述问题，本专利技术采取以下技术方案:利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的EGFRmutT790M、EGFRmutL858R、EGFRmutdeI 和 Krasmut 四种基因序列的突变位点，用 PrimerExpress Software 5.0 软件设计 PCR 引物。用于检测EGFRmutT790M突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2组成的引物对。上游引物:5，-gtcatcaagtctgcctcacctccaccct-3’SEQ ID No:I下游引物:5，-agcaggtactgggagccatt-3JSEQ ID No:2用于检测EGFRmutL858R突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的引物对。上游引物:5，-gtcatcaagtcttggaggaccgtcgcat-3，SEQ ID No:3下游引物:5，-tcttccgcacccagcact-3’SEQ ID No -A用于检测EGFRmutdel突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID N0:6组成的引物对。上游引物:5，-gtcatcaagtgagaaagttaaaattcccgtgg-3，SEQ ID No:5下游引物:5，-cagcaaagcagaaactcacaac-3JSEQ ID No:6用于检测Krasmut突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的引物对。上游引物:5，-gtcatcaagtcagaaaatgactgaatataaacttgag-3，SEQID No:7下游引物:5，-gctgtatcgtcaaggcactgt-3，SEQ ID本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测厄洛替尼、吉非替尼靶向用药基因突变的方法，其特征在于，具体步骤为：利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的EGFRmutT790M、EGFRmutL858R、EGFRmutdel和Krasmut四种基因序列的突变位点，用Primer?Express?Software?5.0软件设计PCR引物；采用多重PCR的方法对待检测样本进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建，ISP(Ion?SphereTM?Particles，Ion微球)模板的制备，在Ion?Torrent?PGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢毅，
申请(专利权)人：龙脉上海健康管理服务有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。