一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法技术

本发明专利技术属于肺癌吉非替尼耐药模型构建技术领域，具体涉及一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法的专利申请。该方法包括：构建非小细胞肺癌PDX模型、筛选吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型、诱导构建非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型三个过程。本发明专利技术可以作为由非小细胞肺癌吉非替尼耐药的肿瘤组织直接构建的PDX模型的替代品，对于研究吉非替尼耐药机制，筛选吉非替尼耐药过程的靶点和小分子药物，进而延缓或干预吉非替尼耐药过程提供了较好的研究基础，具有较好的推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肺癌吉非替尼耐药模型构建
，具体涉及一种非小细胞肺癌吉 非替尼耐药PDX模型的构建方法的专利申请。
技术介绍
肺癌位居全球癌症死亡率中的第一位，非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%。非小细胞肺癌5年生存率小于15%，主要原因是大约70% 的患者首次诊断为非小细胞性肺癌时已处于晚期，多合并有远处转移。肺癌是率先在临床 中应用靶向治疗的癌症种类之一。在过去的十年中，小分子化合物酪氨酸激酶抑制剂在临 床上广泛应用于NSCLC患者的靶向治疗，其靶点为表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Rec印tor，EGFR)。吉非替尼是在临床上应用于EGFR突变的NSCLC患者的靶向药 物之一。吉非替尼治疗非小细胞肺癌中取得了显著的疗效，然而吉非替尼靶向治疗长期使 用后，几乎所有患者都会产生耐药性。因此，模拟NSCLC肺癌吉非替尼耐药过程并深入明确 NSCLC吉非替尼耐药机制具有重要意义。 对于吉非替尼敏感的NSCLC患者治疗中，吉非替尼耐药性的出现严重限制了其临 床疗效。为了研究吉非替尼获得性耐药机制，许多人非小细胞肺癌细胞系被诱导为吉非替 尼耐药细胞系，例如HCC827、PC-9、A549长期暴露于吉非替尼，最终就会诱导成为吉非替尼 耐药细胞系HCC827GR、PC9/ZD和A549GR。利用这种方法所建立的吉非替尼耐药细胞系，国 内外许多研究进行了 NSCLC吉非替尼耐药机制研究。揭示了 3种不同的耐药机制：60%非 小细胞肺癌产生获得性吉非替尼耐药的原因是由于特定的EGFR发生了突变，主要是T790M 突变；22%是某些基因的扩增，例如，MET、HER2、BRAF、AXL、MAPK1或者PIK3CA等；还有4% 是从非小细胞肺癌到上皮细胞肺癌的组织转变，或者是具有干细胞特性；还有10%耐药机 制则是不清楚的。然而，由于这些细胞经过多代体外培养而具有同质性，从而导致其并不能 充分反映临床病人肿瘤组织中的肿瘤异质性，因而存在较大的局限性。因此，要找到有效的 治疗方法来干预NSCLC患者发生吉非替尼耐药的过程，深入研究获得性吉非替尼耐药的发 生机制，迫切需要一种能够真实反映 NSCLC患者肿瘤特征，并有效模拟NSCLC患者吉非替尼 耐药发生过程的动物模型。 将人肿瘤组织直接接种于免疫缺陷小鼠而构建出的人组织来源的移植瘤 (patient-derived xenografts，Η)Χ)模型充分保留了患者肿瘤组织学异质性，因此，在过 去的十年中各种肿瘤PDX移植瘤模型广泛建立，并在组织学、基因水平和药理作用水平得 到广泛认可。PDX模型的建立提供了一个临床研究应用的前期平台，并且被广泛应用于评价 新的临床治疗方案和筛选分子靶标。目前非小细胞肺癌吉非替尼耐药的PDX模型一直未能 成功构建。然而，建立吉非替尼耐药的PDX模型有两个方法，一个是直接将吉非替尼耐药的 非小细胞肺癌组织进行接种构建，一个是筛选出吉非替尼敏感的NSCLC PDX模型给予吉非 替尼进行诱导。第一种构建方法的不足吉非替尼耐药的非小细胞肺癌病人通常处于癌 症晚期，没有机会进行手术，通常通过穿刺进行再次诊断，而穿刺所取得的组织量少，因此 很难得到足够多耐药组织进行PDX模型构建。2吉非替尼耐药是长时间服用吉非替尼后发 生耐药的，吉非替尼发生耐药发生之前是无法分阶段对病人进行穿刺获得吉非替尼耐药过 程中的组织。因此，我们采取第二种方法即构建NSCLC PDX模型，筛选出对吉非替尼敏感的 模型组，然后采用逐步增加吉非替尼剂量的方法诱导NSCLC移植瘤发生吉非替尼耐药，充 分模拟了 NSCLC患者吉非替尼耐药发生过程，为进一步研究吉非替尼耐药发生机制和筛选 干预耐药过程药物提供了临床前平台。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法，所构建 的非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型可以作为直接用吉非替尼耐药组织构建的PDX模型 的替代品，并模拟了 NSCLC患者发生吉非替尼耐药过程，对于研究吉非替尼耐药机制，筛选 吉非替尼耐药过程的靶点和小分子药物，进而延缓或干预吉非替尼耐药过程具有重要的意 义和实用价值。 下面对本专利技术的详细技术方案介绍如下。 -种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法，包括以下步骤： (1) 首先构建非小细胞肺癌（NSCLC) H))(模型，具体为： 首先，获得非小细胞肺癌病人的组织样本，具体为：对临床确诊为非小细胞肺癌、且术 前均未接受过放疗和化疗的病人，在获得其同意并办理相关手续后，取其肿瘤组织作为样 本，即人来源的非小细胞肺癌肿瘤样本； 其次，将所获得的人来源的非小细胞肺癌肿瘤样本处理后，常规操作植入，所形成的肿 瘤即为移植瘤； 监控植入人来源非小细胞癌肿瘤(移植瘤)的SCID小鼠生长情况，当肿瘤长到有坏死或 者液化现象时(此时肿瘤体积一般在500~1500 mm3左右)，应及时进行传代； 当肿瘤(移植瘤）被稳定传代至三代或三代以上时则认为该非小细胞肺癌（NSCLC) rox 模型构建成功； (2) 对步骤（1)中所构建的非小细胞肺癌（NSCLC) PDX模型进行评价，筛选出吉非替尼 敏感的非小细胞肺癌Η?模型；具体为： 首先，对所构建的非小细胞肺癌（NSCLC) PDX模型中肿瘤生长界限进行记录和判定， 所述肿瘤生长界限即移植瘤在小鼠体内生长时坏死或者出现液化现象时的肿瘤体积临界 值； 其次，对所构建的非小细胞肺癌（NSCLC) PDX模型中肿瘤进行病理学和免疫组化染色 评价，所述免疫组化染色评价采用如肺鳞癌的标记物CK5/6、P63和P40 (CK5/6、P63和P40 是在临床上公认的鳞癌标记指标)，肺腺癌的标记物TTF-1、CK8/18和NapsinA (TTF-1、 CK8/18和NapsinA是在临床上公认的腺癌标记指标）等进行评价，以确定移植瘤类型为典 型的非小细胞癌移植瘤； 最后，对所构建的非小细胞肺癌（NSCLC)PDX模型中肿瘤的EGFR基因进行突变检测，检 测时可采用现有的检测试剂盒(如北京雅康博生物科技有限公司的"人EGFR基因突变检测 试剂盒)，通过荧光PCR法定性确定EGFR基因类型；根据EGFR突变情况筛选出吉非替尼敏 感的非小细胞癌PDX模型， 对吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型中的EGFR基因突变类型具体如：L858R、 L861Q、G719C、Exonl9 缺失等； 对于吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型发生耐药后基因型改变情况，出现EGFR T790M 基因突变，c-Met, HER2, BRAF, AXL, MAPK1 或者 PIK3CA 基因扩增等。 (3)构建非小细胞肺癌吉非替尼耐药H))(模型，具体为： 对步骤（2)中筛选获得的吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型，给予吉非替尼灌胃 处理，剂量从l〇~l〇〇mg/kg逐步增加给药，从而诱导获得性非小细胞肺癌吉非替尼耐药FOX 模型； 诱导过程中，吉非替尼诱导剂量先从l〇mg/kg升至50mg/kg，再从50mg/kg升至100mg/ kg ； 为便于检测，可在每个剂量产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）首先构建非小细胞肺癌PDX模型，具体为： 首先，获得非小细胞肺癌病人的组织样本；其次，将所获得的人来源的非小细胞癌肿瘤样本处理后，植入SCID小鼠；当肿瘤被稳定传代至三代或三代以上时则认为该非小细胞肺癌PDX模型构建成功；（2）对步骤（1）中所构建的非小细胞肺癌PDX模型进行评价，筛选出吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型；具体为：首先，对所构建的非小细胞肺癌PDX模型中肿瘤生长界限进行记录和判定，所述肿瘤生长界限即移植瘤在小鼠体内生长时坏死或者出现液化现象时的肿瘤体积临界值；其次，对所构建的非小细胞肺癌PDX模型中肿瘤进行病理学和免疫组化染色评价；最后，对所构建的非小细胞肺癌PDX模型中肿瘤的EGFR基因进行突变检测；根据EGFR突变情况筛选出吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型，（3）构建非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型，具体为：对步骤（2）中筛选获得的吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型，给予吉非替尼灌胃处理，剂量从10~100mg/kg逐步增加给药，从而诱导获得非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘康栋，江亚南，赵继敏，张翼，董子钢，董子明，吴琼，尹学善，王艳红，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41