5‑脂氧合酶通路蛋白联合预测食管癌患者预后试剂盒制造技术

本发明专利技术是联合5‑脂氧合酶代谢通路蛋白抗体检测食管癌患者石蜡包埋手术标本的表达情况进而预测患者预后的试剂盒。该试剂盒包括3种目的蛋白的抗体‑5‑LO、FLAP、LTA4H抗体，还包括山羊血清、0.01M柠檬酸盐修复液、3％H2O2、Polymer增强剂、Polymer聚合物、DAB显色试剂、PBS溶液。而本发明专利技术所采用的5‑脂氧合酶代谢通路蛋白联合预测患者预后的试剂盒比单个指标检测具有更高的预测效果，仅次于TNM分期的预测能力，并且本发明专利技术所基于的免疫组织化学超敏型二步法是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及联合5-脂氧合酶通路蛋白抗体并利用免疫组织化学超敏型二步法去检测食管癌患者标本的表达情况进而预测患者预后的试剂盒。
技术介绍
食道鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC)是我国一种常见的上消化道恶性肿瘤，在国人的恶性肿瘤死亡率中位居第四位。全世界每年40余万的新发食管癌病例中，一半以上发生在我国，我国也是世界上公认的食管癌第一高发国。上世纪70年代，在全国范围内实施了恶性肿瘤普查，确立河北磁县、河南林县、山西阳泉、四川盐亭、广东潮汕和江苏淮安等地区为中国食管癌六大高发区。准确预测食管癌患者的预后对于临床进一步的治疗和随访具有重要意义。然而，目前除了国际TNM分期外还没有一种简便有效的方法可以更加准确地预测食管癌患者的预后。TNM分期预测患者的预后比较繁琐，需要准确地评价肿瘤的浸润深度、转移淋巴结的个数、肿瘤有无远处转移等，而本专利技术所采用的5-脂氧合酶代谢通路蛋白联合预测患者预后的试剂盒比单个指标检测具有更高的预测效果，仅次于TNM分期的预测能力，并且本专利技术所基于的免疫组织化学超敏型二步法是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。本试剂盒中5-脂氧合酶代谢通路抗体蛋白的背景介绍如下。食管癌与炎症的关系日受重视，而白三烯是重要的促炎因子，可激活白细胞、促进单核细胞与血管内皮的粘附、增加血管通透性。我们的前期研究证实，在食管鳞癌5-LO代谢通路中，除了5-脂氧合酶(5-LO)过表达外还有其他两个酶蛋白5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)和白三烯A4水解酶(LTA4H)的过表达，即由花生四烯酸到白三烯的整个代谢通路发生了异常，促进了食管鳞癌的发生与发展。5-LO除了在正常白细胞中表达外，在许多肿瘤的上皮细胞中也发现了5-LO的表达，而在大多数正常上皮细胞中5-LO是不表达的。尽管5-LO在各种恶性肿瘤中高表达的报道很多，但关于这种高表达与患者的生存期的关系如何尚不清楚，本专利技术的前期研究发现5-LO在食管癌组织中高表达并与患者的不良预后密切相关。FLAP蛋白是一种膜结合蛋白，位于细胞核膜或内质网膜上。FLAP需与花生四烯酸结合并把花生四烯酸提供给5-LO，从而激活5-LO途径。有研究报道FLAP在乳腺癌中高表达，是乳腺癌的独立预后因子。本专利技术的前期研究发现FLAP在食管癌组织中高表达并与患者的不良预后密切相关。5-LO完全激活后可将花生四烯酸氧化成5-羟基过氧四烯酸，并经生物转化生成白三烯A4(LTA4)，后者在LTA4水解酶(LTA4H)的作用下产生LTB4。LTA4H在肿瘤组织中表达的研究甚少。本专利技术的前期研究发现LTA4H在食管癌组织中高表达并与患者的不良预后密切相关。虽然上述每种蛋白均具有预测食管癌患者预后的能力，但把3种蛋白联合起来预测食管癌患者的预后则具有更强的判断效能，仅次于国际公认的TNM分期的预测能力。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于免疫组织化学方法的3个蛋白抗体联合预测食管癌患者预后的试剂盒。其中，上述的免疫组织化学方法主要是检测中性福尔马林固定和石蜡包埋的标本。其中，上述试剂盒主要包括3种蛋白抗体，分别是5-LO、FLAP和LTA4H抗体。其中，上述试剂盒还包括：山羊血清，0.01M柠檬酸盐修复液，3％H2O2，Polymer增强剂，Polymer聚合物，DAB显色试剂，PBS溶液。附图说明图1是5-LO蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2＝4.388，P＝0.036)。图2是FLAP蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2＝4.544，P＝0.033)。图3是LTA4H蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2＝5.006，P＝0.025)。图4是3种蛋白联合后判断该人群的Kaplan-Meier生存曲线(X2＝5.922，P＝0.015)。图5是ROC曲线(注：3种蛋白联合后形成的曲线下面积最大，为0.573)。具体实施方式我们收集了297例2007-2011年的食管癌患者的手术标本存档蜡块。下面结合附图实施例作进一步详细描述。免疫组织化学超敏型二步法步骤如下。标本经连续切片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，用超敏型二步法检测目的蛋白的表达，具体方法如下。(1)切片经0.01M柠檬酸盐修复液抗原修复、3％H2O2灭活内源性过氧化物酶、山羊血清封闭后，分别与5-LO、FLAP、LTA4H抗体4℃孵育过夜。(2)切片与Polymer增强剂和Polymer聚合物分别孵育后经DAB显色。(3)切片经苏木素复染核，梯度酒精脱水，二甲苯透明和中性树胶封片。(4)切片在完成上述每步后均经PBS溶液洗涤。所有的免疫染色切片经2位病理医师采用盲法独立评分。肿瘤细胞浆中出现棕黄色颗粒被认为是阳性信号。染色强度分为4级：0，阴性；1，弱染色；2，中度染色；3，强染色。阳性细胞百分数分为5级：0，0～5％；1，6～25％；2，26～50％；3，51～75％；4，≥76％。每个标本的总分数是由肿瘤细胞染色强度和肿瘤细胞阳性百分数两部分的乘积得出的，范围是0～12。为了方便统计，我们把所有病例分为低表达和高表达2组，1代表低表达组，2代表高表达组，其cut-off值根据X-tile软件确定。5-LO：0～4分为低表达组，5～12分为高表达组；FLAP：0～2分为低表达组，3～12分为高表达组；LTA4H：0～4分为低表达组，5～12分为高表达组。3个指标联合起来判断食管癌患者预后的方程式如下。Y＝α×A+β×B+γ×C，其中α、β、γ为系数，通过Cox回归可以得出数值，故方程式变为Y＝0.345×A+0.416×B+0.287×C。A、B、C为该例标本中3个蛋白的表达状态，1代表低表达，2代表高表达。计算出每例标本的Y值后按照从小到大的顺序排列，其中位于中间位置的病例对应的Y值为cut-off值，即1.464。小于等于该值的病例为低危组，高于该值的病例为高危组，这样分成2组后再进行单因素统计分析。此外，也可以通过绘制ROC曲线去比较每个蛋白形成的曲线下面积(AUC)的大小。数据的统计学处理。使用SPSS13.0统计软件处理数据。各蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移状态、TNM分期之间的关系使用Chi-Square检验；各蛋白的表达与患者的生存时间的关系使用Kaplan-Meier生存分析；预测影响患者预后的独立危险因素使用Cox比例风险回归模型；每种蛋白预测食管癌患者预后的效能使用ROC曲线；P＜0.05被认为有统计学显著性。结果显示：3个蛋白的表达都与食管癌患者的TNM分期及淋巴结转移状态密切相关。Cox风险回归模型检测各蛋白单独或联合表达后的Risk值及是否是患者预后的独立危险因素如下。5-LO的表达状态与患者的生存时间密切相关，并且还是独立的预后因子(Risk＝1.412，95％CI＝1.014-1.967，P＝0.041)。FLAP的表达状态与患者的生存时间密切相关，但不是独立的预后因子(Risk＝1.515，95％CI＝0.99-2.322，P＝0.055)。LTA4H的表达状态与患者的生存时间密切相关，并且还本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种预测食管癌患者预后的试剂盒，其特征在于试剂盒中包括抗5‑脂氧合酶(5‑LO)、抗5‑脂氧合酶激活蛋白(FLAP)、抗白三烯A4水解酶(LTA4H)三种蛋白抗体。

【技术特征摘要】
1.一种预测食管癌患者预后的试剂盒，其特征在于试剂盒中包括抗5-脂氧合酶(5-LO)、抗5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)、抗白三烯A4水解酶(LTA4H)三种蛋白抗体。2.根据权利要求1所述的预测食管癌患者预后的试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包括山羊血清、0.01M柠檬酸盐修复液、3％H2O2、Polymer增强剂、Polymer聚合物、DAB显色试剂、PBS溶液。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒在制备联合预测食管癌患者预后的试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于使用试剂盒所检测的标本为中性福尔马林固定和石蜡包埋的组织蜡块。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所使用的检测方法为免疫组织化学超敏型二步法。6.根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于预测食管癌患者预后的方法包括如下步骤：标本经切片、脱蜡、水化后用超敏型二步法检测目的蛋白的表达。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于预测食管癌患者预后的方法具体如下：切片经脱蜡至水、抗原修复、灭活内源性过氧化物酶和山羊血清封闭后，分别与一抗5-LO、FLAP、LTA4H在保湿盒内孵育过夜；随后分别与Polymer增强剂和Polymer聚合物孵育后经DAB显色和苏木素复染细胞核；最后经酒精脱水和二甲苯透明后用中性树胶封片，并对每张免疫组化染色切片进行评分。8.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：白春英，张俊毅，史铁伟，瑞云，许秀娥，吴健谊，许丽艳，李恩民，
申请(专利权)人：赤峰学院，汕头大学医学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15