一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法技术

本发明专利技术涉及肿瘤类器官的培养领域，具体涉及一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法。所述专用培养基包括受体酪氨酸激酶配体、Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂、维生素和激素、抗氧化剂和抑制细胞分化的通路的激动剂。本发明专利技术通过条件去分化的分步培养技术，实现肿瘤细胞短时间内快速扩增成类器官。这一分步培养的技术使得原代细胞可以快速形成类器官，并在有效地时间内获得足够多的细胞开展后续实验操作，提高了类器官的培养速度和成功率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤类器官的培养领域，具体涉及一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法。
技术介绍
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％。全世界每年约有20～30万人死于食管癌。食管癌在我国消化系统肿瘤中应该是排第一位的，在整个肿瘤排序中位次也很高，约四五位水平。与其他国家相比较，我国的食管癌发病率是比较高的，全球近一半的食管癌发生在中国。我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家，每年食管癌发病和死亡人数都占全球人数一半以上。可见，食管癌可以算做最具中国特色的恶性肿瘤之一。食管癌的发病与环境和遗传因素有关，但确切原因和发病机制还不清楚。与胃癌，肝癌类似，由于西方国家的发病率相对较低，致使世界范围内食管癌的研究较其他西方高发的肿瘤落后。而作为我国发生率最高，致死率最高的几种肿瘤之一，加强食管癌的发病机理研究和药物研发有非常重大的现实意义。现有的食管癌细胞系主要通过长期培养，自发永生化或者转染促使正常细胞永生化的癌基因获得。例如Het-1A是一株由人正常食管上皮细胞，通过转染Sv40病毒的大T抗原，使细胞得到永生化而获得。这些方法改变了细胞的遗传背景，长期培养的细胞系，也容易造成基因组不稳定，可能导致肿瘤细胞系的表型和体内肿瘤细胞发生人为的改变，影响食管癌科学研究和药法研发的准确性。之前的食管癌原代培养模式，把肿瘤细胞与其它细胞分离后，种植于细胞培养皿中，细胞失去了原有的微环境。因此细胞很难长期稳定培养。因此，在体外模拟肿瘤生长的微环境，提供肿瘤赖以生存的三维支撑和多种生存通路，有可能实现在体外长期稳定的培养肿瘤组织。体外原代肿瘤细胞类器官的培养，需要提供模拟肿瘤在体内的微环境。这些微环境包括维持三维立体培养状态的细胞外基质、维持生存重要通路的生长因子、抑制细胞分化的因子、各种维生素、微量元素、激素、能量代谢、抗氧化因子、精细的化学同步信号和抗调亡物质。每一种肿瘤类型，甚至不同的肿瘤细胞亚型，这些微环境因素都可能大不相同，因此，不同肿瘤类型的细胞原代类器官培养，需要针对这种肿瘤的类型，逐一优化。原有类器官培养技术应用到人食管癌类器官培养有如下问题：第一代培养时间较长，需要2至6周才能完成第一代培养；传代后类器官的活力迅速下降，生长速度明显减慢；冻存后复苏效率低，容易死亡，活力降低，生长速度减慢；培养的成功率不高，手术获取的新鲜标本不足60％；对于活检标本，原有类器官培养技术几乎无法有效培养。食管癌细胞的肿瘤类器官培养，使在小鼠和人干细胞类器官培养的条件基础上，结合食管癌细胞的特点，进一步优化条件，以利用更小的组织，在更短的时间内，获得更好的细胞活力和更高的成功率。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，所述专用培养基包括以下组分：(1)受体酪氨酸激酶配体，(2)Rho相关的卷曲蛋白激酶(ROCK1、ROCK2)抑制剂，(3)维生素和激素，(4)抗氧化剂，(5)抑制细胞分化的通路的激动剂。优选地，所述受体酪氨酸激酶配体包括人或动物的表皮细胞生长因子(EGF)、人或动物肝细胞生长因子(HGF)和人或动物碱性成纤维生长因子(bFGF)中的一种或多种。优选地，所述人或动物的表皮细胞生长因子的浓度范围为2ng/mL～100ng/mL；人或动物肝细胞生长因子的浓度范围为10ng/mL～200ng/mL；人或动物碱性成纤维生长因子的浓度范围为5ng/mL～100ng/mL。优选地，所述Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂包括Fasudil、Y-27632、RKI-1447和GSK429286A中的一种或多种。优选地，所述维生素和激素包括腐胺、肾上腺酮、烟酰胺和维生素A醋酸酯中的一种或多种。优选地，所述腐胺的浓度范围为0.1μg/mL～100μg/mL；肾上腺酮的浓度范围为10ng/mL～10μg/mL；烟酰胺的浓度范围为1μg/mL～2mg/mL；维生素A醋酸酯的浓度范围在10ng/mL～500ng/mL。优选地，所述抗氧化剂包括还原型谷胱甘肽(GSH)、维生素C、维生素E和β-巯基乙醇中的一种或多种。优选地，所述β-巯基乙醇的浓度范围为0.01mM～1.5mM。优选地，所述抑制细胞分化的通路的激动剂包括人激活素A蛋白、Wnt通路激动剂、Hedgehog通路激动剂中的一种或多种。优选地，所述人激活素A(activin A)蛋白的浓度范围为5ng/mL～200ng/mL；Wnt通路激动剂包括重组人或动物的Wnt3a蛋白、重组人或动物RSPO-1蛋白、GSK-3β抑制剂中的一种或多种；Hedgehog通路激动剂包括重组人或动物SHH蛋白，SMO蛋白的激动剂SAG中的一种或多种。优选地，所述专用培养基包括以下组分：ECRM-I：DMEM/F12培养基，添加2.5％胎牛血清(FBS)、1x B27添加剂、抗坏血酸、维生素A醋酸酯、肾上腺酮、腐胺、烟酰胺、胰岛素、氢化可的松、人激活素A、FGF2、Wnt3a、EGF、视黄酸和Y27632；或者ECRM-II：DMEM/F12培养基，添加2.5％胎牛血清、1x B27添加剂、烟酰胺、肾上腺酮、BMP4、EGF、Wnt3a、IGF、丁酸钠、腐胺、维生素A醋酸酯、胰岛素、地塞米松、β-巯基乙醇、FGF2、人激活素A、视黄酸和Y27632；或者ECRM-III：DMEM/F12培养基，添加1％牛血清白蛋白(BSA)、1x B27添加剂、过氧化氢霉、维生素A醋酸酯、烟酰胺、肾上腺酮、丁酸钠、胰岛素、地塞米松、腐胺、还原型谷胱甘肽、人激活素A、EGF、BMP4、FGF1、NOG、SAG、RSPO1、Wnt3a和Y27632；或者EDM-1：DMEM/F12培养基，添加2.5％胎牛血清、1x B27添加剂、HGF、IGF、Wnt3a、EGF、人激活素A、肾上腺酮、维生素A醋酸酯、烟酰胺、胰岛素、还原型谷胱甘肽。一种利用基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基的培养方法，包括以下步骤：(1)将新鲜获取的食管癌标本组织，用组织清洗液清洗；(2)经清洗后的食管癌标本组织转移入组织转移液中，置于0到4摄氏度转移或短期保存；(3)从组织转移液中取出组织块，在组织清洗液中漂洗后，转移到无菌细胞培养皿中，吸掉多余液体；(4)根据组织块的大小，加入组织消化液，用灭菌剪反复剪碎组织；(5)把剪碎的组织转移到无菌离心管中，继续加入2～10mL组织消化液，清洗转移培养皿中的肿瘤组织，并入无菌离心管中；(6)将无菌离心管置于37摄氏度摇床中消化，不时取出观察，消化到多以寡细胞团或单细胞为止；(7)将无菌离心管中的悬浮液经过70μm细胞筛网，滤过液转移到50mL离心管中；(8)向50mL离心管中加入10～30mL PBS，100～300g离心2～5分钟，弃上清，用10～30mL PBS重悬，再次100～300g离心2～5分钟；(9)小心地吸去离心管中的上清液，加入3～8mL食管癌肿瘤类器官的专用培养基，重悬细胞；(10)取50～200μL细胞悬本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，其特征在于，所述专用培养基包括以下组分：(1)受体酪氨酸激酶配体；(2)Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂；(3)维生素和激素；(4)抗氧化剂；(5)抑制细胞分化的通路的激动剂；所述受体酪氨酸激酶配体包括人或动物的表皮细胞生长因子、人或动物肝细胞生长因子和人或动物碱性成纤维生长因子中的一种或多种；人或动物的表皮细胞生长因子的浓度范围为2ng/mL～100ng/mL；人或动物肝细胞生长因子的浓度范围为10ng/mL～200ng/mL；人或动物碱性成纤维生长因子的浓度范围为5ng/mL～100ng/mL；所述Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂包括Fasudil、Y‑27632、RKI‑1447和GSK429286A中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，其特征在于，所述专用培养基包括以下组分：(1)受体酪氨酸激酶配体；(2)Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂；(3)维生素和激素；(4)抗氧化剂；(5)抑制细胞分化的通路的激动剂；所述受体酪氨酸激酶配体包括人或动物的表皮细胞生长因子、人或动物肝细胞生长因子和人或动物碱性成纤维生长因子中的一种或多种；人或动物的表皮细胞生长因子的浓度范围为2ng/mL～100ng/mL；人或动物肝细胞生长因子的浓度范围为10ng/mL～200ng/mL；人或动物碱性成纤维生长因子的浓度范围为5ng/mL～100ng/mL；所述Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂包括Fasudil、Y-27632、RKI-1447和GSK429286A中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，其特征在于：所述维生素和激素包括腐胺、肾上腺酮、烟酰胺和维生素A醋酸酯中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，其特征在于：所述腐胺的浓度范围为0.1μg/mL～100μg/mL；肾上腺酮的浓度范围为10ng/mL～10μg/mL；烟酰胺的浓度范围为1μg/mL～2mg/mL；维生素A醋酸酯的浓度范围在10ng/mL～500ng/mL。4.根据权利要求1所述的一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，其特征在于：所述抗氧化剂包括还原型谷胱甘肽、维生素C、维生素E和β-巯基乙醇中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，其特征在于：所述β-巯基乙醇的浓度范围为0.01mM～1.5mM。6.根据权利要求1所述的一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，其特征在于：所述抑制细胞分化的通路的激动剂包括人激活素A蛋白、Wnt通路激动剂、Hedgehog通路激动剂中的一种或多种。7.根据权利要求6所述的一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，其特征在于：所述人激活素A蛋白的浓度范围为5ng/mL～200ng/mL；Wnt通路激动剂包括重组人或动物的Wnt3a蛋白、重组人或动物RSPO-1蛋白、GSK-3β抑制剂中的一种或多种；Hedgehog通路激动剂包括重组人或动物SHH蛋白，SMO蛋白的激动剂SAG中的一种或多种。8.根据权利要求1所述的一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基，其特征在于，所述专用培养基包括以下组分：DMEM/F12培养基，添加2.5％胎牛血清、1xB27添加剂、抗坏血酸、维生素A醋酸酯、肾上腺酮、腐胺、烟酰胺、胰岛素、氢化可的松、人激活素A、FGF2、Wnt3a、EGF、视黄酸和Y27632；或者DMEM/F12培养基，添加2.5％胎牛血清、1xB27添加剂、烟酰胺、肾上腺酮、BMP4、EGF、Wnt3a、IGF、丁酸钠、腐胺、维生素A醋酸酯、胰岛素、地塞米松、β-巯基乙醇、FGF2、人激活素A、视黄酸和Y27632；或者DMEM/F12培养基，添加1％牛血清白蛋白、1xB27添加剂、过氧化氢霉、维生素A醋酸酯、烟酰胺、肾上腺酮、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云霞，
申请(专利权)人：张云霞，
类型：发明
国别省市：北京;11