本发明专利技术公开了一种肿瘤靶向诊断用小肽，所述小肽是通过对噬菌体展示环七肽库进行多轮筛选得到，其序列为SCDSWHYWC。本发明专利技术将该小肽用FITC标记，并检测标记后的小肽与FAP结合的活性，结果显示本发明专利技术的小肽能特异性结合FAP。本发明专利技术小肽可以用于制备针对肿瘤基质的广谱探针，可以满足肿瘤分子成像和肿瘤靶向治疗等方面的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多肽，具体而言涉及一种结合FAP的多肽。
技术介绍
目前，恶性肿瘤已经逐渐取代心脑血管疾病，成为人类的头号杀手。最近统计资料表明，我国每年新发现癌症患者约2000万人，近150万人死于癌症。癌症的死亡人数占 总死亡数的1/5。肿瘤的早期诊断与治疗是提高其治愈率及改善病人生存质量的关键。肿瘤的基本特征是细胞的失控性生长，肿瘤细胞自身基因结构及基因表达的改变导致肿瘤的发生发展已被大家广泛接受是。然而随着研究的深入，传统观念正被改变，肿瘤的发生发展并非由上皮或间质单方面决定，而是由两者相互作用所构成的肿瘤-宿主界面微环境的平衡状态所决定[Tlsty TD, Coussens LM. Tumor stroma and regulation ofcancer development. Annu Rev Pathol 2006; I (I) :119-50]。肿瘤微环境调控着肿瘤的多种生物学行为，为肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等提供了必要的物质基础。肿瘤相关成纤维细胞(Tumor-associated fibroblasts)是上述微生态环境中最主要的宿主细胞之一，它通过直接的细胞-细胞接触、可溶性因子的分泌和对细胞外基质的修饰而对该体系的平衡起着重要的调控作用。肿瘤相关的成纤维细胞占肿瘤组织的50% 90%，主要分布于肿瘤基质内、靠近肿瘤血管内皮细胞并包绕着癌巢[Loeffler M, Kriiger JA, NiethammerAG，Reisfeld RA. . R. Targeting tumor-associated fibroblasts improves cancerchemotherapy by increasing intratumoral drug uptake J. Clin.1nvest, 2006(7),116 1955-1962]。肿瘤相关成纤维细胞是非转化细胞且基因组非常稳定，与正常组织成纤维细胞差异显著，并且在各种肿瘤中的差异较小，因而有可能成为肿瘤早期诊断和抗肿瘤治疗的新的切入点。成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein, FAP)是肿瘤相关成纤维细胞的核心标志物，属II型膜结合糖蛋白属于丝氨酸蛋白水解酶家族，在脊椎动物的进化过程中高度保守。且FAP仅选择性表达于胚胎，间叶组织、上皮组织来源的肿瘤中与肿瘤分级、转移及预后密切相关。FAP是肿瘤基质成纤维活化细胞稳定表达的标志分子，是肿瘤靶向诊断的理想靶点，针对FAP设计的小肽分子探针能够避开肿瘤细胞本身的异质性，从而提高肿瘤诊断灵敏度和特异性，有可能成为肿瘤靶向诊断有前途的通用型探针，为肿瘤的分子成像提供新的思路。本专利技术拟以FAP为靶点，采用噬菌体肽库技术筛选FAP高亲和力配体小肽，为肿瘤靶向诊断提供一种新的方法。
技术实现思路
为提高肿瘤诊断灵敏度和特异性问题，本专利技术提供一种多肽，所述多肽能够特异性结合FAP，所述多肽其氨基酸序列为SCDSWHYWC。本专利技术通过筛选卩遼菌体展示环七肽库(Ph. D. _C7CTMPhage display peptidelibrary)，筛选得到对FAP具有高特异性和高亲和力的多肽Ml，具体筛选方法如下以FAP包被免疫试管并封闭，TBST洗涤后加入噬菌体肽库，振荡孵育一定时间后，TBST洗涤去除非特异结合的噬菌体，加噬菌体洗脱液振荡洗脱特异结合的噬菌体，加中和液，取部分洗脱产物计数噬菌体的滴度，其余洗脱产物感染大肠杆菌ER2738扩增并纯化噬菌体，得到次级库。逐步降低FAP包被浓度，再进行两轮筛选。从第三轮计数平板上随机挑到若干个菌落，培养、纯化得到噬菌体后，通过噬菌体ELISA测定各株噬菌体对FAP的结合。通过噬菌体ELISA方法，筛选得到25株对FAP结合的噬菌体。对所述25株噬菌体测序，分析测序结果得到有7株多肽序列，将所述多肽序列分别为命名P1-P7。呈现频率最高的三种多肽共有SCD(XX)H(XX)WC序列；其中多肽序列Pl的出现频率为4/25，其氨基酸序列为S⑶SWHYWC，所表达的多肽命名为Ml。将多肽Ml合成并用荧光标记，检测荧光标记的多肽Ml与FAP的结合，结果显示所得荧光标记的多肽Ml能够与FAP特异性结合。所述Ml的合成可以为生物方法的 表达，也可以是化学方法的合成，所述化学方法优选固相合成方法；所述突光标记优选FITC(fluorescein isothiocyanate)标记。本专利技术多肽Ml能特异性结合FAP，将有望用于解决具有广谱适用性的肿瘤靶向分子成像技术难题，为肿瘤的早期诊断提供重要手段；该多肽Ml还可用于肿瘤靶向治疗药物的制备。本专利技术所用的缓冲液、培养基等说明如下PBS :磷酸缓盐冲溶液(Na2HPO41OmmoI/L，KH2P042mmol/L，NaCl 137mmol/L, KCl2. 7mmol/L, pH7. 4, Solarbio, China)；PBST (PBS,0. 05 % Tween 20(sigma), I % BSA(ablum bovine fraction V,WAK0)；TBS Tris 缓冲盐溶液(50mmol/L, pH 7. 5, sigma)；TBST 50mmol/L TBS+0. 05% Tween 20 (sigma)；甘氨酸-HCl0. 2mol/L Glycine-HCl (pH 2. 2, solarbio, China)；PEG/NaCl 溶液含 20% (ff/V)聚乙二醇-8000，2. 5mol/LNaCl, sigma ；封闭缓冲液PBS+5mg/mLBSA (WAKO)LB液体培养基10g/L细菌培养用胰蛋白胨(Oxford)，5g/L细菌培养用酵母提取物(Oxford),5g/L NaCl(sigma)；顶层琼脂糖培养基LB培养基+7g/L琼脂糖(sigma)；LB/IPTG/Xgal 琼脂平板(0. 05g/L isopropyl- β -D-thiogalactoside (IPTG),0. 04g/L 5-Bromo-4-chloro-3-1ndolyl- β -D-galactoside (Xgal), 15g/L 琼脂粉(agar),si gma)附图说明图1特异性噬菌体富集第一轮至第三轮噬菌体回收率；图2ELISA测定Pl与FAP的结合；图3标记FITC的Ml与FAP结合活性测定。具体实施例方式通过参阅下述实施例可以更容易地了解本专利技术的内容，这些实施例只是为进一步说明本专利技术，并不意味着限定本专利技术的范围。本专利技术(包括以下实施例)中涉及的噬菌体滴度测定均采用下述方法(参见Ph. D. TMPhage Display Library 操作手册)接种E. coli ER 2738单菌落于5-10ml LB液体培养基中，37°C，250rpm摇床孵育至对数中期(0D600 : O. 5);微波炉加热融化顶层琼脂糖培养基，分成3mL/份分装到灭菌试管中，每个噬菌体稀释度用一管，保存于45°C备用；37°C预温LB/IPTG/Xgal琼脂平板，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用；用LB培养液对噬菌体进行10倍比系列稀释(建议稀释范围扩增的噬本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：SCDSWHYWC。
【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SCDSWHYWC。2.编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列。3.权利要求1中所述多肽在制备肿瘤分子成像试剂中的应用。4.权利要求1中所述多肽在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。5....
【专利技术属性】
技术研发人员：刘敏，王双坤，
申请(专利权)人：刘敏，王双坤，
类型：发明
国别省市：
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