本发明专利技术公开了一种拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163以及利用该菌株发酵制备特戊酸依罗霉素的方法。拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163已于2015年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015445，保藏地址：中国武汉市武汉大学。本发明专利技术所述的拟无枝菌酸菌YIM M13163能够发酵产生抗生素特戊酸依罗霉素；同时，本发明专利技术利用该菌株制备特戊酸依罗霉素的方法简单，得率高，从而为特戊酸依罗霉素的药物价值的开发提供了足够的样品支持，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于工业微生物
，具体涉及一种海洋放线菌拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163以及利用该菌株制备特戊酸依罗霉素（efrotomycinpivalate）的方法。
技术介绍
依罗霉素（efrotomycin）具有广泛的生物活性，如在体外实验中，它对莫拉克斯氏菌属、巴氏杆菌属、耶尔森氏鼠疫杆菌、嗜血杆菌属、链球菌属和棒状杆菌属等动物病原菌有良好的抗菌活性。对依罗霉素的抑菌活性测试表明，它对铜绿假单胞菌、大肠杆菌有稍弱的抑菌活性，而对苏云金芽孢杆菌有较强的抑菌活性。这些良好的生物活性说明依罗霉素具有潜在的药物开发价值。但是，该化合物由于来源途径稀缺，仅在上个世纪80年代被人少量发现，由于获得依罗霉素的量较少，阻碍了对其进一步的研究。因此，寻找新的途径获得足够量的依罗霉素，对于依罗霉素的研发具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有依罗霉素研究的技术不足，提供一种新的能够发酵制备特戊酸依罗霉素（efrotomycinpivalate）的拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.YIM M13163）。该菌发酵产生的特戊酸依罗霉素（efrotomycinpivalate），是一种含二糖的依罗霉素类抗菌素，本专利技术另一个目的是提供所述拟无枝菌酸菌在制备抗生素特戊酸依罗霉素中的应用。本专利技术再一个目的是提供上述拟无枝菌酸菌制备特戊酸依罗霉素的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163，该菌株于2015年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015445。该菌株是从我国南海海底沉积物中分离获得，利用该菌株可以制备足量的特戊酸依罗霉素，具有很好的应用前景。上述拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163在制备特戊酸依罗霉素中的应用也在本专利技术的保护范围之内。一种利用上述拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163制备特戊酸依罗霉素的方法，具体是将拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163发酵得到发酵培养物，从发酵培养物中制备得到特戊酸依罗霉素。进一步地，上述制备特戊酸依罗霉素的方法包括如下步骤：S1.将拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163进行恒温恒速液态发酵，得到发酵培养物；将该发酵培养物的发酵上清液与菌丝体分开；S2.用丁酮萃取发酵上清液，丁酮相经旋蒸冷凝浓缩之后得到浸膏A；S3.用丙酮浸泡萃取菌丝体，超声处理得到丙酮浸提液，浸提液经旋蒸冷凝浓缩后得到浸膏B；S4.浸膏A和/或浸膏B经正相硅胶柱层析提取馏分，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。其中，作为一种可实施的优选方案，步骤S1所述发酵培养物的制备方法如下：将活化的拟无枝菌酸菌YIM M13163接入种子培养基中，于25～30℃、180～220 rpm条件下恒温恒速培养30～40h后，按照2～5v/v%的接种量，转接到发酵培养基，于25～30℃、180～220 rpm条件下恒温恒速培养9 d，得到发酵培养物；其中，所述种子培养基和发酵培养基的配方均为：可溶性淀粉2g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取粉2g/L，蛋白胨2g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO32g/L，25g/L海盐，NaCl4g/L。更优选地，步骤S1所述发酵培养物的制备方法如下：将活化的拟无枝菌酸菌YIM M13163接入种子培养基中，于28℃、200 rpm条件下培养36 h后，按照4v/v%的接种量，转接到发酵培养基，于28℃、200 rpm条件下培养8d，得到发酵培养物。另外，上述制备特戊酸依罗霉素的方法中，步骤S1所述发酵培养物是经4000r/min离心10 min得到发酵上清液和菌丝体；步骤S2所用丁酮与发酵上清液的体积比为1：1，反复萃取3次；步骤S3所用丙酮与菌丝体的体积比为1：1，反复萃取3次。优选地，步骤S4所述浸膏A和/或浸膏B经正相硅胶柱层析，以体积比100：1～1：100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，得到的馏分合并后，再以甲醇或体积比10：1～1：10的乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，得到的馏分合并后，进行中压反相柱层析，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。更进一步优选地，浸膏A经正相硅胶柱层析，以体积比4～49：1的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，得到的各馏分随机合并后，再以甲醇或体积比1～9：1的乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，得到的各馏分随机合并后，进行中压反相柱层析，得到的各馏分随机合并后，再进行中压反相柱层析，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素；浸膏B经正相硅胶柱层析，以体积比4～12：1的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，得到的各馏分随机合并后，再以体积比1～4：1的乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。其中，所述纯化是经 60～100%的乙腈溶液（CH3CN/H2O）梯度洗脱30min，流速2.5 mL/min，保留时间16.7min。利用上述方法制备纯化得到的特戊酸依罗霉素也在本专利技术的保护范围之内，其分子式为C59H88N2O20，其结构式如式（I）所示：，其中，R为式（II）所示：。另外，式（I）所示的特戊酸依罗霉素在抑菌方面的应用，和/或在制备抑菌药物中的应用，也均在本专利技术的保护范围之内。优选地，所述菌为铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或苏云金芽孢杆菌。更优选地，所述菌为苏云金芽孢杆菌。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一株新的拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163，可以产生特戊酸依罗霉素。本专利技术还提供了一种新的特戊酸依罗霉素抗生素的生产工艺，即利用拟无枝菌酸菌YIMM13163制备特戊酸依罗霉素的方法，得到的特戊酸依罗霉素对多种病菌具有很好的抗菌活性，比如铜绿假单胞菌、大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌，尤其是对苏云金芽孢杆菌有很强的抑菌活性；MIC（最小抑菌浓度）检测测得特戊酸依罗霉素对苏云金芽孢杆菌的MIC值达到2 μg/mL。这些良好的生物活性说明特戊酸依罗霉素具有潜在的药物开发价值，具有广泛的应用前景。另外，本专利技术制备特戊酸依罗霉素的方法简单易实施，产品得率高，为特戊酸依罗霉素的药物价值的开发提供了足够的样品支持，对于依罗霉素的研发和应用推广具有重要的意义。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本专利技术的范围。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本专利技术所用试剂和材料均为市购。实施例1拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163，其特征在于，该菌株于2015年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015445。
【技术特征摘要】
1.一种拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163，其特征在于，该菌株于2015年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015445。2.权利要求1所述拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163在制备特戊酸依罗霉素中的应用。3.一种利用权利要求1所述拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，是将拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163发酵得到发酵培养物，从发酵培养物中制备得到特戊酸依罗霉素。4.根据权利要求3所述制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163进行恒温恒速液态发酵，得到发酵培养物；将该发酵培养物的发酵上清液与菌丝体分开；S2.用丁酮萃取发酵上清液，丁酮相经旋蒸冷凝浓缩之后得到浸膏A；S3.用丙酮浸泡萃取菌丝体，超声处理得到丙酮浸提液，浸提液经旋蒸冷凝浓缩后得到浸膏B；S4.浸膏A和/或浸膏B经正相硅胶柱层析提取馏分，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。5.根据权利要求4所述制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，步骤S1所述发酵培养物的制备方法如下：将活化的拟无枝菌酸菌YIM M13163接入种子培养基中，于25～30℃、180～220 rpm条件下恒温恒速培养30～40h后，按照2～5v/v%的接种量，转接到发酵培养基，于25～30℃、180～220 rpm条件下恒温恒速培养9 d，得到发酵培养物；其中，所述种子培养基和发酵培养基的配方均为：可溶性淀粉2g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取粉2g/L，蛋白胨2g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO3 2g/L，25g/L海盐，NaCl 4g/L。6.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文均，刘晴，陈微，高锐，段焰青，侯伟，鞠建华，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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