一种利用米曲霉发酵产L-苹果酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用米曲霉发酵产L‑苹果酸的方法，属于发酵技术领域。本发明专利技术以米曲霉为生产菌株，向装液量20％的发酵培养基中，接入10％的孢子悬液，加入60～80g/LCaCO3，30～34℃通风培养120h。本发明专利技术采用米曲霉发酵糖质原料生产苹果酸，其产酸水平最高可达103.2g/L，原料价格低廉，成本低；并且，本发明专利技术是采用单菌发酵，需要的培养基成分简单，发酵条件简单易控制，还避免了与黄曲霉混合发酵会产生毒素的问题，本发明专利技术提供的以糖质原料发酵生产L‑苹果酸的工艺具有重要的经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用米曲霉发酵产L-苹果酸的方法，属于发酵

技术介绍
苹果酸(Malic acid)又名二羟基丁二酸，是一种重要的四碳平台化合物，被美国能源部列为12种有潜力化合物之一。它是TC生物体循环的重要中间产物，具有特殊愉快的酸味，易被人体吸收利用，因此作为性能优异的食品酸味剂和功能性食品广泛应用于食品行业。同时具有抗氧化、抑制油脂酸败等作用，被用于化妆品、医药、化工行业。目前，苹果酸的生产方法主要有：生物催化法、两步发酵法和一步发酵法。国内外以生物催化法为主，其中日本是L-苹果酸主要的生产国与出口国。(1)生物催化法以富马酸为底物经富马酸酶转化生成苹果酸。其原料价格高、成品中杂酸高以及生物污染较大；(2)两步发酵法指经两种微生物分两阶段发酵生产苹果酸。其发酵周期长、副产物多、分离纯化成本高以及培养条件复杂，目前正处于实验室研究水平；(3)一步发酵法指经一种微生物发酵获得苹果酸。其发酵条件简单，生产成本低。糖质原料发酵法工艺中，一步发酵法和混合发酵法都有较大进展，但有关的研究报道尚少。混合发酵法由于涉及到两种微生物，培养条件要求比较严格，发酵周期较长，产酸率较低，副产物较多。一步发酵法多采用黄曲霉作为生产菌株，但其黄曲霉在发酵时易产生黄曲霉毒素，使其发酵工艺困难，难于用于工业化生产。
技术实现思路
本专利技术提供了一种发酵产L-苹果酸的方法。所述方法，是以米曲霉为生产菌株，是向装液量20％的发酵培养基中，接入10％的孢子悬液，加入60～80g/L CaCO3，30～34℃通风培养120h；所述发酵培养基以g/L计，含有：120葡萄糖、3胰蛋白胨、0.15KH2PO4、0.15K2HPO4、0.10MgSO4·7H2O、0.10CaCl2·H2O、0.05NaCl、0.01柠檬酸、0.05FeSO4·7H2O，pH自然。在本专利技术的一种实施方式中，所述孢子悬液中孢子的数量为106个/mL。在本专利技术的一种实施方式中，发酵温度为34℃。在本专利技术的一种实施方式中，所述CaCO3浓度为80g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述米曲霉，购买于CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)，编号为:CICC2005。在本专利技术的一种实施方式中，所述孢子悬液的制备过程为：将米曲霉菌株斜面菌种接入种子培养基，30℃，200rpm，培养14h。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子培养基以g/L计含有：30葡萄糖、3胰蛋白胨、0.56 KH2PO4、0.56 K2HPO4、0.925 NaH2PO4·H2O、0.82 Na2HPO4、0.075 MgSO4·7H2O、0.075CaCl2·H2O、0.05 NaCl、0.05 FeSO4·7H2O、0.01柠檬酸，pH自然。本专利技术采用米曲霉发酵糖质原料生产苹果酸，其产酸水平最高可达103.2g/L，原料价格低廉，成本低；并且，本专利技术是采用单菌发酵，需要的培养基成分简单，发酵条件简单易控制，还避免了与黄曲霉混合发酵会产生毒素的问题，本专利技术提供的以糖质原料发酵生产L-苹果酸的工艺具有重要的经济价值。附图说明图1不同温度对米曲霉生产L-苹果酸产量的影响具体实施方式残糖测定方法：发酵样品8000r/min离心10min，取上清稀释一定倍数，吸取1mL稀释过后的样品于20mL比色管，加入1.5mLDNS试剂，准确水浴加热5min，快速冷却至室温后定容到10mL，在波长540nm测量吸光值并记录。L-苹果酸测定方法：采用HPLC法测定。流动相：0.1mol/L KH2PO4，pH2.8；流速：0.6mL/min；柱温：25℃；检测器：紫外检测器；波长：215nm；柱子：C18。加入1倍体积的2mol/LHCL将发酵液中的碳酸钙溶解完全后，8000r/min离心10min，吸取上清稀释一定倍数过膜处理用液相测定。以下实施例所用米曲霉，购买于CICC，编号为:CICC2005。实施例1 不同碳源对米曲霉生产L-苹果酸产量的影响采用的培养基，以g/L计：分别添加120葡萄糖、淀粉、麦芽糖、果糖和乳糖做碳源，3大豆蛋白胨、0.15 KH2PO4、0.15 K2HPO4、0.10 MgSO4·7H2O、0.10 CaCl2·H2O、0.05 NaCl、0.01柠檬酸、0.005 FeSO4·7H2O、60 CaCO3、pH自然。在温度30℃，200r/min转速下，发酵120h。结果如表1所示。由表1可见，除乳糖外，各类糖类都能作为较好的碳源，其中以葡萄糖作为碳源，其产酸量最高。表1不同碳源对米曲霉生产L-苹果酸的影响碳源种类浓度(g/L)残糖(g/L)L-苹果酸(g/L)葡萄糖12015.177.0淀粉1205.569.5麦芽糖12015.655.2果糖12040.243.0乳糖12055.810.8实施例2 不同氮源对米曲霉生产L-苹果酸产量的影响采用的培养基，以g/L计：分别添加3胰蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硫酸铵、玉米浆和黄豆饼粉作为氮源，120葡萄糖、0.15 KH2PO4、0.15 K2HPO4、0.10 MgSO4·7H2O、0.10CaCl2·H2O、0.05 NaCl、0.01柠檬酸、0.005 FeSO4·7H2O、60 CaCO3、pH自然。在温度30℃，200r/min转速下，发酵120h。结果如表2所示。由表2可知，采用胰蛋白胨和大豆蛋白胨效果较好，其中以胰蛋白胨作为氮源效果最好。表2不同氮源对米曲霉生产L-苹果酸的影响氮源种类浓度(g/L)残糖(g/L)L-苹果酸(g/L)胰蛋白胨313.672.7大豆蛋白胨39.265.1尿素318.138.4硫酸铵315.448.2玉米浆310.243.3黄豆饼粉315.638.4实施例3 不同温度对米曲霉生产L-苹果酸产量的影响采用的培养基，以g/L计：120葡萄糖、3胰蛋白胨、0.15 KH2PO4、0.15 K2HPO4、0.10MgSO4·7H2O、0.10 CaCl2·H2O、0.05 NaCl、0.01柠檬酸、0.005 FeSO4·7H2O、60 CaCO3、pH自然。分别设定温度为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃。在200r/min转速下，发酵120h。结果图1所示。由图1可知，温度在34℃以前L-苹果酸的产量随着温度的升高而增加，温度在36℃时开始下降，故选取最佳发酵温度为34℃。实施例4 不同碳酸钙添加量对米曲霉生产L-苹果酸产量的影响采用的培养基，以g/L计：120葡萄糖、3胰蛋白胨、0.15 KH2PO4、0.15 K2HPO4、0.10MgSO4·7H2O、0.10 CaCl2·H2O、0.05 NaCl、0.01柠檬酸、0.005 FeSO4·7H2O、pH自然。其中，CaCO3的添加浓度分别为60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L。在发酵温度34℃，200r/min转速下，发酵120h。结果见表3所示。由表3可知，当碳酸钙浓度为80g/L时，L-苹果酸的产量达到94.69g/L。故选择碳酸钙添加浓度为80g/L。表3不同氮源对米曲霉生产L-苹果酸的影响CaCO3浓度(g/L)残本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵产L‑苹果酸的方法，其特征在于，以米曲霉为生产菌株，是向装液量20％的发酵培养基中，接入10％的孢子悬液，加入60～80g/L CaCO3，30～34℃通风培养120h；所述发酵培养基以g/L计，含有：120葡萄糖、3胰蛋白胨、0.15KH2PO4、0.15K2HPO4、0.10MgSO4·7H2O、0.10CaCl2·H2O、0.05NaCl、0.01柠檬酸、0.05FeSO4·7H2O，pH自然。

【技术特征摘要】
1.一种发酵产L-苹果酸的方法，其特征在于，以米曲霉为生产菌株，是向装液量20％的发酵培养基中，接入10％的孢子悬液，加入60～80g/L CaCO3，30～34℃通风培养120h；所述发酵培养基以g/L计，含有：120葡萄糖、3胰蛋白胨、0.15KH2PO4、0.15K2HPO4、0.10MgSO4·7H2O、0.10CaCl2·H2O、0.05NaCl、0.01柠檬酸、0.05FeSO4·7H2O，pH自然。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孢子悬液中孢子的数量为106个/mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵温度为34℃。4.根据权利要求1所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，陈修来，周洁，袁亦舟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32