一种使用水葫芦作为发酵原料制备丁二酸的方法，如下：（1）水葫芦的预处理：（2）一级培养，将菌种放入种子培养液中进行培养，培养时间为14h；（3）二级培养，一级培养后接种子培养基，接种量为4%，培养时间达到7h后得培养液；（4）三级培养，将培养液接入发酵培养基，在发酵罐中二氧化碳的通入量为0.5~5L/min，发酵过程中流加摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液维持发酵系统的pH值在5.5~6.5之间，温度为37~39℃，发酵时间为48h，发酵结束时钠离子浓度达到1.5%~2%，发酵结束后得丁二酸。生产成本低廉的同时，做到了降低对环境的污染的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利设及一种使用水葫芦作为生物发酵的碳源制备下二酸的方法，属于生物工 程
技术介绍
水葫芦，又名凤眼莲、水浮莲，凤眼莲属，我国于20世纪Ξ十年代作为饲料从南 美引入。水葫芦多生长在富营养化的水中，生长速度是世界上公认最快的，一般春末开始生 长，夏季及秋初时节大量繁殖，生长速度最快时，全株生物质干物质可达170吨每公顷。 由于近年来环境污染越来越严重加上水葫芦旺盛的繁殖能力，同时在新环境中缺 乏天敌，水葫芦在我国很多地区泛滥，堵塞河道，铺满水面，造成严重的危害。另外，水葫芦长满覆盖整个湖面，水中的其他植物不能很好生长，水中的生态平衡 就会被打破。大量被拱出后的水葫芦堆积如山，又进一步对环境造成了很大的危害。 而另一方面，水葫芦中含有十分丰富的纤维、蛋白质、氨基酸、粗脂肪及各种微量 元素，因此，若利用微生物发酵水葫芦制备相应的产品，又可W减少污染，逐渐形成使用水 葫芦处理污水，定期收集作为微生物发酵的原料的生物循环体系，运对企业和社会具有重 要的现实意义。目前国内外的对于水葫芦作为发酵原料的研究重点多集中在使用酵母菌的发酵 转化清洁可再生的燃料乙醇。但是由于燃料乙醇的附加值低，不能够最大地提高水葫芦的 经济效益；另外，目前商用的用于制备乙醇的酵母菌大多不能利用半纤维素水解产生的木 糖，运对于半纤维素含量相对较高的水葫芦无疑又降低了利用效率。 下二酸（succinicacid)又名班巧酸，广泛存在于生物体中，是一种重要的二元有 机簇酸，也是微生物Ξ簇酸循环糖酵解途径的重要代谢产物。下二酸在很多领域有着广泛 的应用，可用于合成可降解塑料，医药领域的镇定剂，食品工业的食品添加剂，表面活性剂 等。因此，下二酸的高效、低成本的生产方法也成为近年来研究的热点，其中采用生物发酵 的方法制备下二酸是重中之重。 降低生物发酵法下二酸制备成本的一个主要方向是使用低廉的碳源，如何有效的 利用自然界的生物资源，既能满足人们正常的生活需求，又能降低对环境的污染是一个非 常有意义的课题。无疑，综合利用水葫芦将对企业和社会具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服W上不足，提供一种使用水葫芦作为发酵原料制备下二 酸的方法。 本专利技术的目的运样实现： 一种使用水葫芦作为发酵原料制备下二酸的方法，其制备方法如下： (1)本专利技术水葫芦的预处理： ①先将水葫芦原料进行离屯、甩干，得干燥的水葫芦；将水葫芦用摩尔浓度为2% - 3%的 氨氧化钢水溶液在120度条件下浸泡2小时，水葫芦与氨氧化钢水溶液的质量比为1:10; ② 浸泡结束后，将固体滤出，使用去离子水清洗，冲洗至中性，加入巧樣酸或其他有机 酸调整溶液抑至4. 0~4. 5,溫度调整到38~40度，此时溶液的固液比为1:10,按质量比计； ③ 将诺维信纤维素酶Carezyme?450化加入到经步骤（1)②处理的溶液中进行水解，时 间为48小时，诺维信纤维素酶Carezyme?45(K)L的投加量为水葫芦固体物中纤维素与半纤 维素含量的10%，质量为2.6g;将溶液中固体滤除，并收集滤出液，此滤出液为纤维素酶水 解液； ⑥将纤维素酶水解液进行浓缩，浓缩至总糖含量达到350g/l，得水解糖液； (2)配置发酵培养基 采用去离子水配制发酵培养基lOOmU发酵培养基的组成成分按质量浓度计为：蛋白 腺5g/l，玉米浆lOg/l，总还原糖含量lOOg/l，憐酸二氨钟2. 5g/l，憐酸氨二钢2. 5g/l，酵 母膏5g/l，乙酸钢1邑/1，用去离子水配制，其中总还原糖取自所述水解糖液。 (3) -级培养 将班巧酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1593放入种子培养液中进 行培养，培养时间为14h。[001引 （4)二级培养 一级培养后接种子培养基，接种量为4%，培养时间达到化后得培养液。[001引 （5)S级培养 将培养液接入发酵培养基，在发酵罐中二氧化碳的通入量为化/min,发酵过程中流 加摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢溶液维持发酵系统的抑值在5. 5~6. 5之间，溫度为 37~39°C，发酵时间为4她，发酵结束时钢离子浓度达到1. 59?^2%，发酵结束后得下二酸。 上述一种使用水葫芦作为发酵原料制备下二酸的方法，其中，优选地，所述发酵过 程中流加摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢溶液维持发酵系统的抑值为6.0~6.2。 上述一种使用水葫芦作为发酵原料制备下二酸的方法，其中，发酵使用的碳源为 莲皮粉经过处理得到的纤维素、半纤维素水解后的产物。 本专利技术的有益效果为： 通过对水葫芦的预处理，将水葫芦内的木质素去除，采用酸解和酶解将半纤维素和纤 维素转化为发酵下二酸所需的糖源，运对于降低生物法制备下二酸的原料成本和降低水葫 芦对于环境的污染有极大的作用。本专利技术采用水葫芦生产下二酸，设计合理的工业步骤，产 出的下二酸杂质低，利用率高。生产成本低廉的同时，做到了降低对环境的污染的要求。【具体实施方式】 实施例中所用到的水葫芦产生长于于镇江扬中西来桥镇临江水塘，主要项目包括 纤维(包括半纤维素）含量，蛋白含量，灰分含量，水含量。 蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法，参考GB/T5009. 5-1985。 纤维的测定，是通过将干燥后的定量的水葫芦在浓硫酸和重铭酸钟的混合液中进 行氧化分解，并使用硫代硫酸钢反滴过量的高儘酸钟的方法。 水分的测定，采用直接干燥法，参考GB/T-14769-93。 灰分的测定，参考GB5009. 4-85 根据W上方法的检测，水葫芦（干）含有纤维及半纤维素25. 56%，蛋白含量为37. 5%， 灰分14. 2%，其他含量(包括木质素）为22. 74%。 从上述结果可W看出，水葫芦中可利用作为碳源的物质主要是纤维素。 实验中发现，水葫芦纤维素与木质素结构较为致密，预处理需要使用稀碱。 本专利技术实施例中所使用的TSB培养液为膜蛋白腺大豆肉汤。本专利技术所用菌株班巧酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1593， 已在中国专利化200610038113. 6中公开，公开号CN1814747A，公开日2006年8月9日。 下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例1 一种使用水葫芦作为发酵原料制备下二酸的方法，其制备方法如下： (1) 本专利技术水葫芦的预处理： ②先取lOOKg水葫芦，对水葫芦原料进行离屯、甩干，然后烘干至基本无水，得干燥的水 葫芦2.化g;将水葫芦用摩尔浓度为2. 5%的氨氧化钢水溶液在120度条件下浸泡2小时， 水葫芦与氨氧化钢水溶液的质量比为1:10; ② 浸泡结束后，将固体滤出，使用去离子水清洗，冲洗至中性，加入巧樣酸调整溶液抑 至4. 0~4. 5,溫度调整到38~40度，此时溶液的固液比为1:10,按质量比计； ③ 将诺维信纤维素酶Carezyme?450化加入到经步骤（1)②处理的溶液中进行水解，时 间为48小时，诺维信纤维素酶Carezyme?45(K)L的投加量为水葫芦固体物中纤维素与半纤 维素含量的10% ;将溶液中固体滤除，并收集滤出液，此滤出液为纤维素酶水解液； ⑥将纤维素酶水解液进行浓缩，浓缩至总糖含量达到350g/l本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用水葫芦作为发酵原料制备丁二酸的方法，其制备方法如下：本专利技术水葫芦的预处理：先将水葫芦原料进行离心甩干，得干燥的水葫芦；将水葫芦用摩尔浓度为2%—3%的氢氧化钠水溶液在120度条件下浸泡2小时，水葫芦与氢氧化钠水溶液的质量比为1: 10；②浸泡结束后，将固体滤出，使用去离子水清洗，冲洗至中性，加入柠檬酸或其他有机酸调整溶液pH至4.0~4.5，温度调整到38~40度，此时溶液的固液比为1:10，按质量比计；③将诺维信纤维素酶Carezyme®4500L加入到经步骤（1）②处理的溶液中进行水解，时间为48小时，诺维信纤维素酶Carezyme®4500L的投加量为水葫芦固体物中纤维素与半纤维素含量的10%，质量为2.6g；将溶液中固体滤除，并收集滤出液，此滤出液为纤维素酶水解液；⑤将纤维素酶水解液进行浓缩，浓缩至总糖含量达到350g/L，得水解糖液；（2）配置发酵培养基采用去离子水配制发酵培养基100mL，发酵培养基的组成成分按质量浓度计为：蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，总还原糖含量100g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠1 g/L，用去离子水配制，其中总还原糖取自所述水解糖液；（3）一级培养将琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593放入种子培养液中进行培养，培养时间为14h；（4）二级培养一级培养后接种子培养基，接种量为4%，培养时间达到7h后得培养液；（5）三级培养将培养液接入发酵培养基，在发酵罐中二氧化碳的通入量为3L/min，发酵过程中流加摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液维持发酵系统的pH值在5.5~6.5之间，温度为37~39℃，发酵时间为48h，发酵结束时钠离子浓度达到1.5%~2%，发酵结束后得丁二酸。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕涛，
申请(专利权)人：镇江博睿兴邦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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