降解或检测甘油磷酸胆碱的酶学方法、产品及其应用技术

本发明专利技术提供了降解或检测甘油磷酸胆碱(GPC)的酶学方法、产品及其应用。本发明专利技术的方法包括：在适合酶反应的条件下，使甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶同时或先后与样品中的GPC接触，从而降解GPC；对所得反应产物中的无机磷进行定量；根据所测定的无机磷含量确定所述待测样品中甘油磷酸胆碱的含量。本发明专利技术的方法可用于高灵敏度和精确度的快速简便降解和/或检测GPC，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
降解或检测甘油磷酸胆碱的酶学方法、产品及其应用
本专利技术属于生物技术和酶工程领域。更具体而言，本专利技术涉及一种快速简便降解或检测甘油磷酸胆碱含量的酶学方法及其应用。
技术介绍
甘油磷酸胆碱(Glycerophosphocholine,GPC，结构见下式)，是人体内正常存在的水溶性小分子物质。GPC是重要神经传递介质乙酰胆碱(Acetylcholine)的生物合成前体，可以支持大脑和神经系统的功能。在体内，GPC最重要的生理功能在于穿过血脑屏障，为乙酰胆碱和磷脂(PC)的合成提供必要的胆碱。而乙酰胆碱是中枢神经系统中重要的神经传递介质，其帮助脑部完成学习、记忆和认知活动，且能控制浅睡眠和肌动活动。并且，作为一种磷脂类代谢产物,GPC在男性生殖系统的附辜组织及分泌液中具有相当高的含量。近年来，国外许多研究表明精浆中GPC的含量约占人体GPC总量的90％以上，且绝大部分由附睾上皮分泌。精浆中GPC与精子在附睾内发育成熟及受精等过程都密切相关(丁之德等，“我国正常生育力男性精浆中甘油-3-磷酸胆碱含量的研究”，生殖与避孕，1994,14(1):75-76)。由此提示GPC与男性生殖能力和健康的相关性。作为生物体磷脂代谢中的一种重要物质，GPC还与许多疾病存在一定的关联，如与脑缺血型中风、老年痴呆、多发性脑梗死型痴呆、癌症、阿尔兹海默症等(例如参见MoestueS.A.等，“Glycerophosphocholine(GPC)isapoorlyunderstoodbiomarkerinbreastcancer(甘油磷酸胆碱(GPC)是乳腺癌中知之甚少的生物标记物)”.PNAS.2012,109(38):E2506)。近几年，GPC在世界各国引起越来越多的关注(参见赵艳艳等，“甘油磷酸胆碱制备的研究进展”，中国油脂，2013,38(12):50-52)。GPC药物最早在意大利上市，目前已在意大利、波兰、韩国、俄罗斯、希腊、智利、巴西等国家上市，在治疗脑缺血型中风、阿尔茨海默病、多发性脑梗死性痴呆等方面有显著疗效。检测GPC的早期方法包括例如：①使用酸法水解GPC使之产生胆碱，而后使用三碘化物沉淀胆碱并使用分光光度法进行检测(DawsoR.M.C.等，“Glycerylphosphorylcholineandphosphorylcholineinsemen,andtheirrelationtocholine(精液中的甘油磷酸胆碱和磷酸胆碱及其与胆碱的关系)”Biochem.J.,1957,65:627-634)，该方法步骤较为复杂；②使用高碘酸盐氧化GPC并加入甲醛产生生色物质从而检测GPC的方法，但是该方法需要去除果糖等一些杂质等的影响；③先用色谱法纯化GPC，而后通过反应将有机磷转化为无机磷，而后使用定磷法检测磷含量从而得到GPC的量，但是样品中其它磷脂类物质会对结果产生干扰，而且其步骤也十分复杂(ChapJ.H.等，“Simple,RapidEnzymaticDeterminationofGlycerophosphocholineinHumanSeminalPlasma(人精浆中甘油磷酸胆碱的简便快速酶法测定)”，Clin.Chem.1988，34(1):106-109)；等等。相对于这些早期使用的化学法检测，酶法检测GPC具有十分显著的优点，譬如专一性高、检测方法相对简便、耗时短、无需进行分离等优点。ManciniA.等人(ManciniA.等，“Quantitationofglycerophosphorylcholinebyflowinjectionanalysisusingimmobilizedenzymes(采用固定化酶通过流动注射分析定量甘油磷酸胆碱)”，Mol.CellBiochem.，162:83-87，1996)报道了一种使用固定化酶注射分析的方法检测GPC的含量。该方法是将甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶与胆碱氧化酶固定化在一种多孔的玻璃珠上，当含有GPC的样品通过时，GPC会被水解产生游离的胆碱和3-磷酸甘油，其中胆碱又会被胆碱氧化酶氧化产生甜菜碱和过氧化氢，其中的过氧化氢可以通过电流分析的方法进行定量。该方法可以检测10nmol/ml至500nmol/ml的GPC。ChapH.J.等人(ChapJ.H.等，同前，Clin.Chem.1988，34(1):106-109)报道了一种快速简便的酶法检测人精浆中GPC含量的方法，该方法是用PDE(磷酸二酯酶)水解GPC产生胆碱，而后用胆碱氧化酶和过氧化氢酶对其进行定量。美国专利US6,461,830(B1)公开了一种检测甘油磷脂酰胆碱类物质(GPX，与GPC类似只是胆碱可替换为乙醇胺、肌醇、丝氨酸等)的方法，首先使用一种非特异的磷酸二酯酶水解GPX产生3-磷酸甘油，而后采用3-磷酸甘油氧化酶使其产生磷酸二羟丙酮和过氧化氢。磷酸二羟丙酮可在NADH的存在下，在3-磷酸甘油脱氢酶的作用下被还原成3-磷酸甘油，同时NADH被氧化成NAD+进而引起340nm处的吸收值的变化，从而实现GPX的定量。GPC通过水解产生的胆碱可以用胆碱氧化酶氧化产生过氧化氢，该物质与4-氨基比林和苯酚在过氧化物酶的催化下能形成醌亚胺色素，从而在505nm处具有吸收值，因而可以实现GPC的定量。美国专利US2002039757A1和US2003068653A1也公开了类似的检测方法。丁之德等(丁之德等，“我国正常生育力男性精浆中甘油-3-磷酸胆碱含量的研究，生殖与避孕.1994,14(1):75-76.)报道了一种检测精浆中GPC的方法，该方法是将GPC经过酸水解后产生胆碱和3-磷酸甘油，后者在3-磷酸甘油氧化酶存在的条件下被氧化成磷酸二羟丙酮，磷酸二羟丙酮在NADH和3-磷酸甘油脱氢酶存在的情况下被重新还原成3-磷酸甘油，同时产生NAD+。由于NADH在340nm处有吸收而NAD+没有吸收，根据340nm处吸光值的变化可计算出3-磷酸甘油的量，从而可计算出GPC的量。除了酶法检测外，化学发光法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振法检测GPC也有相关报道。如PacificiR.等人(PacificiR.等，“Ahighlysensitivechemiluminescentassayforglycerylphosphorylcholineinhumanseminalplasma(人精浆中甘油磷酸胆碱的高灵敏度化学发光法检测)”，Clin.Biochem.1991,24(6):483-486)报道了一种检测人精浆中GPC的化学发光方法，该方法较普通的分光光度法更灵敏快速。赵艳艳等(赵艳艳等，“甘油磷酸胆碱的鉴别与含量测定”，安徽医药，2012,16(5):601-603)报道了用HPLC-ELSD(蒸发光散射检测器)法定量检测GPC的方法，该方法在100-2000mg/L(即相当于388.8-7775.4nmol/ml)浓度的检测范围内线性良好，平均回收率为99.81％。MuraiS.等人(MuraiS.等，“Animprovedmethodforassayingphosphocholineandglycerophosphocholineinmousetissue(分析小鼠组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降解甘油磷酸胆碱的方法，所述方法包括：在适合酶反应的条件下，使甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶同时或先后与待降解样品中的甘油磷酸胆碱接触。

【技术特征摘要】
1.一种检测甘油磷酸胆碱含量的方法，所述方法包括：(a)提供待测样品；(b)在适合酶反应的条件下，使甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶同时或先后与所述待测样品接触并完全反应；(c)对步骤(b)所得反应产物中的无机磷进行定量；(d)根据步骤(c)中所测定的无机磷含量确定所述待测样品中甘油磷酸胆碱的含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶选自下组：动物来源的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶；植物来源的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶；微生物来源的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶选自下组：哺乳动物来源的GDE5；拟南芥(Arabidopsisthaliana)、白羽扇豆(Lupinusalbus)以及烟草植物来源的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶；来源于酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉或金黄色葡萄球菌的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶选自下组：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或大肠杆菌来源的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶为碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶是具有SEQIDNO:2所示序列的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶选自下组：动物来源的碱性磷酸酶；植物来源的碱性磷酸酶；微生物来源的碱性磷酸酶。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶选自下组：牛小肠碱性磷酸酶CIAP；来源于芸豆(PhaseolusvulgarisL.)根部的碱性磷酸酶、豆类种子中的碱性磷酸酶；来自于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)及米曲霉(Aspergillusoryzae)的碱性磷酸酶。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶为来源于选自下组的豆类种子中的碱性磷酸酶：豌豆(Pisumsativum)、鹰嘴豆(Cicerarietinum)或大豆(Glycinemax)。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶为牛小肠碱性磷酸酶CIAP或地衣芽胞杆菌来源的碱性磷酸酶。11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中的无机磷定量采用选自下组的方法进行：磷钼蓝分光光度法、放射性检测法、钼锑抗比色法、染料结合法、酶联-紫外分光光度法。12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中的无机磷定量采用磷钼蓝分光光度法进行。13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于：甘油磷酸胆碱降解产物的生产；含有甘油磷酸胆碱或甘油磷酸胆碱降解产物的食品、保健品或药品的生产；甘油磷酸胆碱或甘油磷酸胆碱降解产物生产过程监控；含有甘油磷酸胆碱或甘油磷酸胆碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐正军，周美凤，许骏，杨天奎，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31