本发明专利技术公开了一种准确鉴别阿胶原料驴源性成分的特异性引物对及其方法。所述引物对包括引物PF和引物PR，所述引物PF的序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物PR的序列如SEQ ID NO.2所示。使用此方法能准确鉴别阿胶原料驴源性成分，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、酶切、电泳检测即可完成对样品的鉴别，具有操作简单、特异性强、重复性好等优点，可用于阿胶原料驴源性成分的快速鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及名贵中药阿胶原料的品质鉴定
，具体设及一种鉴定阿胶原料 驴源性成分的特异引物对及其方法。
技术介绍
阿胶为《中国药典》2015版的收录品种，为马科动物驴Equus asinm L.的干燥皮或 鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。其药用历史悠久，始载于《神农本草经》，被列为"上品"，称 其"可久服轻身益气"，是药食同源的重要物种，尤其在治未病方面功效显著。关于阿胶的医 方医案有3200多个，其中包括200多个膏方和200多个食疗方。现代研究表明阿胶能调节身 体机能，增强免疫力，在肿瘤辅助治疗、血液病等重大疾病防治上，其治疗优势也正逐步凸 显。仅《中国药典》2015版收载的含阿胶的成药即多达34个。我国驴养殖业发展严重滞后，驴 的存栏数呈逐年下滑之势。W致近年制胶原料驴皮短缺、原料价格上涨，造成目前阿胶市场 混乱，渗杂使假情况屡屡发生，主要渗假成分包括猪皮、牛皮胶、马皮胶甚至皮革下脚料等， 给大众用药安全带来重大隐患。传统的阿胶真伪鉴别方法，采用外观性状和理化性质等方 法，需要极为丰富的个人经验和深厚的专业知识，而各种杂皮胶的制备工艺与正品相似，故 其外观性状极为相近，更大大增加了鉴别的难度。近来有采用近红外光谱技术对阿胶真品 和伪品进行快速区分的报道，但由于正品和伪品之间缺乏特征性指标，易对未知样品造成 误判。故把好原料关对于阿胶及其制品的质量控制相当关键。驴Equus . asinus L.和马 Equus . cabal lus oriental is Noack为同科同属动物，聽子为马和驴的杂交种。驴皮与马 皮、聽皮在毛色、性状等方面十分相近，肉眼很难区分，故市场上W马皮等作为驴皮伪品制 造阿胶较为常见。 因此，寻找一种简单、快速且准确可靠的鉴定阿胶原料驴源性成分的方法显得尤 为迫切。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定阿胶原料驴源性成分的特异引物 对及其方法。 为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为： 所述鉴定阿胶原料驴源性、马源性成分的共用特异性引物对包括引物PF和引物 PR： 引物PF的序列为5'-TTTGCCTTCCACTTTATTCTA-3'（沈Q ID N0.1);[000引 引物PR的序列为5'-GTGTAGGGTAGGGATGAGTG-3'（沈Q ID N0.2)。所述鉴定阿胶原料驴源性成分的方法包括如下步骤： (1)按常规动物组织基因组DM提取法提取待测皮张的DNA;用上述的引物对对待 测阿胶原料皮张的DNA进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物； (2)阿胶原料驴源性成分鉴别：向PCR扩增产物中加入限制性内切酶BamH I进行酶 切，限制性内切酶BamH I的酶切位点为5'…G'GATCC···3' ；将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶 电泳，若在50-35化P出现两个片段(约76bp和314bp)，则供试品为驴源性，若不出现上述两 个片段，则供试品不为驴源性。 步骤(1)中所述扩增体系及条件如下： 聚合酶链式反应WSSliL为参考，各种物品的用量分别为： lOxPC民bu化r (Mg:- plus) 2.5 ^山， clNTPs (2.5mM) 2μΙ； 引物郎（ΙΟμΜ) 〇.5μL., 引物 PR (ΙΟμΜ) 0.5μL^' TaqDNA 巧伯峭(2.5lJ/,uU O.SpL DNA 投板 1.0μΙ_. 去离子水 补齐至25μΙ^， PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s， 53°C 退火 30s，72°C 延伸 453,35个循环后，72°(：延伸1〇111111。 下面对本专利技术设计原理等作进一步说明： 本专利技术首先检索Genbank驴、马及猪、牛、羊等其他物种切tb相关序列（见表1)，下 载代表性序列进行比对分析，在此基础上WOligo软件设计仅能对驴、马获得目的扩增的特 异引物，并经由肥B化tter针对驴与其他物种DNA序列的差异选择合适的DNA限制性内切酶 切位点，通过分析聚合酶链式反应产物的限制性酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别驴源性 成分的目的。 经比对驴与其它8种动物的切tb序列，仅驴、猪和羊在614bp处均有BamH I酶切位 点（图2)，又由于所设计的引物是驴特异性的（图1)，故其他物种一般没有目的PCR产物，即 使有，其PCR产物也不能被BamHI酶切。 从供试皮张中提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(PF、PR)，驴、马、驴聽、 马聽能够扩增出一段DNA片段;进一步用限制性内切酶BamH I (酶切位点为5 '…G'GATCC··· 3'）对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，仅驴、驴聽会在50- 350bp出现两个片段(约76bp和314bp)，而马皮、马聽不会出现上述两片段。当供试样品经用 本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段 的大小，便可W准确地鉴定驴源性成分。 该阿胶原料驴源性成分的PCR-RFLP鉴别方法是综合利用基因序列比对、特异性酶 切位点分析和引物设计等生物信息学技术，并经过反复的实验验证才得W建立。使用此方 法，只需通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、酶切、电泳检测即可完成对驴源性成分的鉴 另IJ，具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。 本专利技术的有益效果是:解决了非驴皮充当原料伪制阿胶而当下对此无力鉴别的难 题，提供了鉴定所需的一对PCR引物、PCR反应条件、一种限制性内切酶。本专利技术利用驴与其 他近似物种DNA序列的差异，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鉴别方法，对于保证阿胶质 量，打击市场上阿胶及其制剂的伪劣品、保障人民用药安全具有重要价值。【附图说明】 图1:驴源、马源性成分的特异引物设计图； 图2:驴源性成分的酶切位点设计图； 图3:驴皮PCR产物电泳图；M: 5化P DNA Ladder Marker(条带大小自下而上依次为 50bp、lOObp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);P1:MP01;1-43:LP01-43;B: 空白对照；[002引图4:马皮PCR产物电泳图；M: 5化P DNA Ladder Marker(条带大小自下而上依次为 50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);P2:LP01;l-6:MP01-06;B: 空白对照图5:驴聽皮PCR产物电泳图；M:5化P DNA Ladder Marker(条带大小自下而上依次 为 50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);Pl:MP01;l-3:LL01-03; B:空白对照； 图6:马聽皮PCR产物电泳图；M: 5化P DNA Ladder Marker(条带大小自下而上依次 为50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);P2:LP01;l-16:ML01-16; B:空白对照； 图7:待定皮张 PCR产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定阿胶原料驴源性成分的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括引物PF和引物PR；所述引物PF的序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物PR的序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗晖明，肖炳燚，聂平，李文莉，刘丽，丁野，舒毕琼，孙辉，
申请(专利权)人：湖南省药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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