本发明专利技术公开了一种治疗癌症的蟾酥靶向脂质体、制备方法及应用。蟾酥靶向脂质体包括靶向部位碳酸酐酶CA9抗体、脂质体、蟾酥。该蟾酥靶向脂质体通过脂质体包裹蟾酥后，与碳酸酐酶CA9抗体连接，可特异性作用于过量表达CA9的癌细胞，靶向杀伤癌细胞。本发明专利技术对制备的蟾酥靶向脂质体进行特性研究、肿瘤细胞MTT实验、体内药效学实验，结果表明蟾酥靶向脂质体比较稳定、不易聚集、靶向性好、治疗指数高。本发明专利技术的蟾酥靶向脂质体可用于治疗结肠癌、膀胱癌、肾癌、子宫颈癌、脑胶质瘤、胃癌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物制剂领域，涉及靶向脂质体，尤其涉及碳酸酐酶CA9抗体修饰的 蟾酥脂质体及其构建方法及其在抗肿瘤中的应用。
技术介绍
蟾酥（Bufotoxin)为蟾蜍（Toad，俗名癞蛤蟆）的耳后腺和皮肤腺体的干燥分泌 物，能强心、兴奋呼吸中枢和横纹肌，具有升高血压、镇痛、平喘、镇咳、抗炎和抗肿瘤作用， 是重要的传统中药材。蟾酥多入丸、散，著名中成药六神丸、喉症丸、梅花点舌丹都含有蟾 酥这味药，除此之外，国家食品药品监督管理局还批准上市的蟾酥药品有蟾酥锭、蟾酥注射 液、蟾酥镇痛膏、复方蟾酥丸、复方蟾酥膏、蟾酥镇痛巴布膏。但蟾酥属2类毒性中药，最高 用量为0. 015-0. 03g，所含的蟾酥毒素通过兴奋迷走神经中枢或末梢，直接作用于心肌，出 现恶心、呕吐、腹泻、腹痛、体力不支、头晕、心悸、胸闷、口唇及四肢麻木等症状，严重者会发 生口唇青紫、抽搐，甚至出现循环、呼吸系统衰竭而导致死亡。这些毒副作用大大增加了蟾 酥临床使用的风险，所以临床合理用药、制剂工艺的改进，对提高药物安全性显得尤为重 要。 1993年，有学者在与人乳腺癌细胞联合培养的宫颈癌的HeLa细胞系中发现了 MN 蛋白。随后的研究发现，该蛋白结构与碳酸酐酶（CA)相似，并被确认为是一种碳酸酐酶的 异构酶，遂被命名为CA9。它是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，由459个氨基酸组成，分布 在细胞膜和细胞核，相对分子质量分别为58kD、54kD。碳酸酐酶CA9参与调节细胞内外的 酸碱度，在肿瘤细胞的生长和存活过程中发挥重要作用。在一般情况下，CA9仅表达于极少 的正常组织，如胃、胆管、胰腺、小肠和输精管上皮，而且表达量极少，而在结肠癌、膀胱癌、 肾癌、子宫颈癌、脑胶质瘤、胃癌中可以高表达碳酸酐酶CA9,现有技术中大部分被用于肿瘤 的诊断，虽然现有技术中有描述可以将CA9用于治疗，但是并没有给出具体怎样利用CA9进 行治疗。
技术实现思路
1、本专利技术的目的。 本专利技术为了解决现有技术中既能有有效利用蟾酥的药性，同时减少蟾酥药物的巨 大毒性对人体产生的毒副作用，并且能够有针对性的对癌细胞进行抑制，减少对人体正常 细胞的伤害和患者治疗痛苦，提高治疗效果，从而提出的一种蟾酥靶向脂质体及其制备方 法和应用。 2、本专利技术所采用的技术方案。 (一）蟾酥靶向脂质体 蟾酥靶向脂质体，括碳酸酐酶CA9抗体、蟾酥和脂质体，蟾酥包裹在脂质体内，并与CA9 连接。更具体地，与CA9连接方式为将CA9抗体连接到脂质体聚乙二醇链末端。 在进一步具体的实施例中，蟾酥靶向脂质体的膜材料选自以下材料：a、天然大豆 卵磷脂或合成的磷脂；b、胆固醇；c、聚乙二醇-磷脂复合物和d、碳酸酐酶CA9抗体-聚 乙二醇-磷脂复合物的组合物。所述的材料c中聚乙二醇-磷脂复合物中聚乙二醇的分子 量为1000-5000 g/mol ;所述的材料d中碳酸酐酶CA9抗体-聚乙二醇-磷脂复合物中聚 乙二醇的分子量为1000-8000 g/ mol。 在进一步具体的实施例中，脂质体膜材料的摩尔比为a : b=4:1-1: 1， a:c=1000:1-1000:100, a:d=1000:1-1000:100。 在进一步具体的实施例中，蟾酥与所述脂质组分的质量比是0. 1%至50%。 在进一步具体的实施例中，脂质体粒径范围为20-200nm。 在进一步具体的实施例中，所述的聚乙二醇-磷脂复合物或碳酸酐酶CA9抗 体-聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或 蛋磷脂酰乙醇胺。 (二）蟾酥靶向脂质体的制备方法 本专利技术的蟾酥靶向脂质体的制备方法，按照如下步骤进行： 1)制备蟾酥脂质体 使用挤出机经过聚碳酸酯过滤器用数个循环挤出，控制粒径在20-200nm之内。 2)制备蟾酥靶向脂质体 添加蟾酥脂质体、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀 酰亚胺、碳酸酐酶CA9抗体，置于4°C条件下反应4-20小时； 3) 纯化 使用透析袋透析，除去未包封的蟾酥、蟾酥脂质体、未连接的碳酸酐酶CA9抗体、 EDC ? HC1.S-NHS ； 4) 干燥 对透析得到的蟾酥靶向脂质体冷冻干燥，得到粉末状样品，以便于保存。 在进一步具体的实施例中，所述的步骤1中蟾酥脂质体的终浓度控制在5-20mg/ ml〇 在进一步具体的实施例中，步骤2中蟾酥脂质体、1-(3_二甲氨基丙基）-3_ 乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳酸酐酶CA9抗体比例为（10-100) : (100-1000)：(100-1000) ： (1-10)〇 在进一步具体的实施例中，所述的步骤2中反应时间为8-12小时。 本专利技术蟾酥靶向脂质体可以应用于制备治疗癌症药物，优选的制备癌症药物包括 结肠癌药物、膀胱癌药物、肾癌药物、子宫颈癌药物、脑胶质瘤药物、胃癌药物。 3、本专利技术的有益效果。 ( 1)本专利技术通过将蟾酥脂质体和CA9的协同作用，能够降低蟾酥的药物毒性，减少 了对人体正常细胞的伤害。 (2)本专利技术将蟾酥脂质体和CA9的结合，其治疗效果也远高于现有技术中的蟾酥 脂质体的治疗效果，抑瘤率高达60%以上。 (3)本专利技术通过将蟾酥脂质体和CA9的制备工艺和协同作用，能够有针对性的到 达癌症病灶区，而现有技术中并没有给出CA9是如何具体制备并应用于治疗癌症药物的方 法。 (4)本专利技术蟾酥靶向脂质体制备工艺简便，碳酸酐酶CA9抗体与蟾酥脂质体耦合 率达到68%-70%，包封率可达80-85%，粒径20-200nm，稳定性较好，蟾酥靶向脂质体在PBS溶 液中16天泄漏率仅为3. 4%。【附图说明】 图1蟾酥靶向脂质体制备示意图 图2蟾酥靶向脂质体随时间变化的渗透率 图3蟾酥靶向脂质体对结肠癌HCT116细胞存活率的影响 图4蟾酥靶向脂质体对宫颈癌hela细胞存活率的影响 图5蟾酥靶向脂质体对肾癌796-P细胞存活率的影响。【具体实施方式】 为了使专利局的审查员尤其是公众能够更加清楚地理解本专利技术的技术实质和有 益效果，申请人将在下面以实施例的方式作详细说明，但是对实施例的描述均不是对本发 明方案的限制，任何依据本专利技术构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应 视为本专利技术的技术方案范畴。 实施例1蟾酥靶向脂质体的制备方法 1、包裹蟾酥脂质体的制备 1)取二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC)60mg，胆固醇（Chol)lOmg，二硬脂酸磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000) 9mg，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交 连物（DSPE-PEG2000-C00H)1.5mg溶于15ml氯仿中（A溶液）；蟾酥溶于甲醇中（B溶液），A 溶液与B溶液按照1:1比例混合，采用薄膜分散法，60°C，40r/min，蒸去氯仿、甲醇。 2)将该脂质膜在10mM的Tris-等渗盐缓冲液（10mM的Tris，137mM氯化钠， 25°C，pH7. 4)水化。将脂质的终浓度控制在5-20mg/ml。 3)然后将所述混合物在80°C (超过所有脂质的转变温度)保持60min以使所述脂 质体结构固化。在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蟾酥靶向脂质体，其特征在于：包括碳酸酐酶CA9抗体、蟾酥和脂质体，蟾酥包裹在脂质体内，脂质体与CA9连接。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨智钧，王锦锦，徐健，卞兆祥，吕爱平，
申请(专利权)人：常熟浸大科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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