一种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法，所述方法是通过对微生物合成尸胺的代谢途径中的关键调控位点进行改造，较优地，所述关键调控位点为赖氨酸转运蛋白基因lysE位点和/或6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi位点，或者，所述关键调控位点为调控上述基因表达的调控位点；关键调控位点的改造方法为敲除赖氨酸转运蛋白基因lysE和/或6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，或者弱化赖氨酸转运蛋白基因lysE和/或6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的表达或酶学活性，从而有效提高尸胺的产量，增加糖类的利用率，降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程菌
，尤其是通过对微生物利用糖类发酵合成尸胺的 代谢途径中的关键调控位点进彳丁改造，从而有效提尚尸胺的广量的一种提尚微生物利用糖 类发酵生产尸胺的方法。
技术介绍
尸胺(Cadaverine)是一种多胺，即1，5-戊二胺（简称戊二胺），在生物体内由赖氨 酸脱羧生成，是广泛存在于生物体中的具有生物活性的含氮碱，但也作为一种肉毒胺存在 于腐败物中。尸胺是合成新型材料聚酰胺_54(由尸胺和琥珀酸缩合而成)和聚酰胺_56(由 尸胺和乙二酸缩合而成）的重要原料，具有重要的工业用途。 目前合成尸胺的方法有化学合成法和酶转化法。化学合成法条件苛刻、污染环境， 酶转化法过程复杂、成本较高。利用基因工程技术构造代谢工程菌来直接规模化制备人类 所需产品是最经济、环保和最有前途的方法，是代谢工程研究的方向和热点。 微生物发酵法生产尸胺就是微生物利用糖类进行发酵，通过代谢直接大量合成尸 胺，这种方法简单、经济、环保和高效。虽然大肠杆菌、尸杆菌、蜂房哈夫尼菌等可以直接合 成尸胺，也对尸胺合成调节进行了广泛研究，但尸胺的产量有待提高。 JP2002223770和一些论文表明通过将赖氨酸脱羧酶基因和/或赖氨酸-尸胺反向 转运蛋白基因 cadB引入到谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌来提高尸胺生产。CN200780006903.9公 开了尸胺合成途径中的一系列基因的敲除、抑制或增强，但是这些文献和专利都没有发现 敲除或弱化赖氨酸转运蛋白基因 lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi可以有效提高尸胺的 产量。 因此，通过对比，本专利技术专利申请与上述公开文献存在本质的不同。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过发现新的能提高微生 物发酵糖类生产尸胺的调控位点，并改变这些位点基因的表达方式来提高尸胺产量的一种 提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法。 为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下： -种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法，通过对微生物合成尸胺的代谢途 径中的关键调控位点进行改造。而且，所述关键调控位点为赖氨酸转运蛋白基因 lysE位点和6-磷酸葡萄糖异构酶 基因 pgi位点，或者调控上述关键调控位点基因表达的这两个基因的调控位点。而且，敲除赖氨酸转运蛋白基因 lysE和/或6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi，和/或 者，通过改变它们的启动子、核糖体结合位点或进行基因突变来弱化它们的表达或弱化酶 的活性。而且，所述微生物为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、蜂房哈夫尼或它们的重组菌株。 而且，改造的具体步骤如下： 通过将肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA克隆至谷氨酸棒杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸 羧激酶基因 pepck位点上，构建出产尸胺谷氨酸棒杆菌重组菌CAD1; 将重组菌株CAD1的赖氨酸转运蛋白基因 lysE敲除，构建出尸胺产量提高了的谷氨 酸棒杆菌重组菌CAD2; 将重组菌株CAD2的6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi敲除，构建出尸胺产量提高了的 谷氨酸棒杆菌重组菌CAD3。 本专利技术取得的优点和积极效果： 1、本方法通过对微生物利用糖类发酵合成尸胺的代谢途径进行改造，通过改造产 尸胺的微生物利用糖类发酵生产尸胺的调控位点，这些调控位点包括赖氨酸转运蛋白基因 lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi，通过敲除和/或弱化赖氨酸转运蛋白基因 lysE和6-磷 酸葡萄糖异构酶基因 pgi，可以有效提高尸胺的产量，从而提高糖类的利用率，降低生产成 本。 2、本方法将赖氨酸转运蛋白基因 lysE敲除并将赖氨酸-戊二胺反向转运蛋白基因 cadB整合至lysE基因位点，阻止它们的表达，来抑制赖氨酸的分泌，同时加速将戊二胺转运 至胞外；将乙酰转移酶基因 Ncgll469敲出可以防止尸胺的降解;将6-磷酸葡萄糖异构酶基 因 pgi敲除，切断糖代谢的糖酵解途径，从而有效提高尸胺的产量。【附图说明】 图1为本专利技术中不同重组菌株尸胺的产量图。【具体实施方式】 下面结合实施例，对本专利技术进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。 本专利技术中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域内的常规方法;本专利技术中所使 用的试剂，如无特殊说明，均为本领域内的常用试剂。 本专利技术所涉及的技术术语的含义： "尸胺" BP1，5-戊二胺。 "重组菌株"指非野生型菌株，包括通过诱变育种、基因工程育种或其它任何方法 获得的非野生型菌株。 "调控位点"指赖氨酸转运蛋白基因 lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi及其所在 位置以及所有调控这些基因表达的其它基因及其所在位置。 "基因敲除"指敲除或突变目的基因、目的基因的核糖体结合位点、目的基因的启 动子或目的基因的调控基因，使目的基因不能表达或者不能表达成有活性的蛋白质(酶）。 "基因弱化"指目的基因的表达水平或酶活性低于微生物在操作前的表达水平或 酶活性。包括通过改变它们的启动子、核糖体结合位点或进行基因突变及其其它任何方法 来弱化它们的表达或弱化酶的活性。本专利技术所运用的技术手段：本专利技术的基因序列包括赖氨酸脱羧酶基因、赖氨酸-尸胺蛋白反向转运基因、赖氨 酸转运蛋白基因 lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi序列都是公开的序列。质粒 pKISmobsacB、分子操作技术、微生物培养技术及尸胺的检测等，对于本领域的技术人员而 目都是公知的。 实施例1 -种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法，所述方法中对于微生物合成尸胺 的关键调控位点进行改造，例如，所述关键调控位点为赖氨酸转运蛋白基因 lysE位点和/或 6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi位点，或者，所述关键调控位点为调控上述基因表达的调控位 点。 较优地，所述对于微生物合成尸胺的关键调控位点进行改造为:敲除赖氨酸转运 蛋白基因 lysE和/或6-磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi，和/或者，通过改变它们的启动子、核糖 体结合位点或进行基因突变来弱化它们的表达或弱化酶的活性。 较优地，所述微生物为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、蜂房哈夫尼或它们的重组菌株。 上述提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法，具体步骤如下： ⑴产尸胺谷氨酸棒杆菌重组菌CAD1的构建 根据NCBI提供的大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基 因 pepck附近的序列设计引物，分别扩增出cadA和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因 pepck的 上、下游同源臂序列pckL和pckR，然后以cadA、pckL和pckR为模板，通过重叠延伸PCR将这 三个片段链接成pckL-cadA-pckR片段，这个片段通过Hind III和BamH I酶切后克隆到 pK18mobsacB的相同酶切位点之间，构建出质粒pK18-pckL_cadA-pckR。用这个质粒转化谷 氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032,并通过菌落PCR筛选出阳性克隆。把筛选出的阳性克 隆接种到至蔗糖平板(10%蔗糖的LB培养基），长出菌落后分别接种到含有卡那霉素和不含 有卡那霉素的LB平板上。含有卡那霉素的LB平板上不生长而不含有卡那霉素的LB平板上生 长的菌落即为可能的cadA基因插入到pepck基因位点的重组菌株，然后再进行菌落本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法，其特征在于：通过对微生物合成尸胺的代谢途径中的关键调控位点进行改造。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黎明，路福平，唐奇，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12