本发明专利技术涉及一种白喉类毒素单克隆抗体及其应用，属于免疫学领域。本发明专利技术将白喉类毒素免疫接种小鼠后，将鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选产生抗白喉类毒素的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.10591,其分泌的单克隆抗体效价高达106，亲和常数为1.62×109M-1，可用于制备白喉类毒素抗原检测试剂盒，也可以应用于酶联免疫法检测白喉疫苗生产过程以及成品疫苗中类毒素的含量检测，具有广泛的应用前景与市场价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学与疫苗学领域，具体涉及一种白喉类毒素单克隆抗体及产生该 抗体的杂交瘤细胞株以及抗体的应用。
技术介绍
白喉是由白喉棒状杆菌（Corynebacteriumdiphtheriae)引起的一种急性上呼吸 传染病，临床表现为上呼吸炎症，通常在咽部，有时在后鼻腔，喉部和气管。某些白喉杆菌菌 种产生强的外毒素，在局部和全身可引起大范围的膜和器官的损害。人是白喉唯一的天然 宿主，通过人与人之间传播，引入白喉免疫前，白喉是引起儿童死亡的一个主要原因。现在 在许多发展中国家白喉仍然流行。 白喉是通过疫苗免疫可以预防的传染病，白喉杆菌产生的外毒素是细菌最重要的 致病因子，20世纪20年代早期，Ramon用少量甲醛处理白喉毒素，发现该产品保留了大多数 免疫原性，但失去毒性，Tamon称之为类毒素。1926年，Glenny以及其同事发现，明研^沉淀 的类毒素更具有免疫原性，到40年代中期，应用白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳疫苗 联合制备菌体百白破联合疫苗（DTP)用于免疫预防白喉、破伤风和百日咳三种疾病。近年 来，无细胞百白破疫苗（DTaP)或许生产以及它与Hib疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗和乙 型肝炎疫苗的联合疫苗已经开发出来。尽管没有白喉的动物宿主存在，但溃疡杆菌可能带有0 -棒状杆菌噬菌体，编码 白喉毒素，动物宿主确实存在这种微生物，即噬菌体。鉴于白喉杆菌在全球的普遍性和噬菌 体与毒素生产相关，消灭白喉的愿望似乎遥远。用白喉类毒素进行主动免疫仍然是控制白 喉的关键。 白喉类毒素是白喉疫苗中的主要活性成分。目前《中华人民共和国药典》2010年 版三部中对于白喉疫苗中白喉类毒素抗原含量的测定主要包括絮状单位试验、蛋白氮含量 测定、SDS-PAGE纯度测定以及效价测定。其中，由于絮状单位试验的结果判定采用观察法， 且试验结果受反应时间和环境温度影响很大，试验结果的准确性和精确性较差；蛋白氮含 量检测通过蛋白氮含量间接推断白喉类毒素含量，检测结果准确性与白喉类毒素纯度密切 相关，受杂质影响较大，精确度和准确度较差；SDS-PAGE法主要用来做对白喉类毒素的鉴 别和定性，无法准确的定量，而效价实验步骤复杂、过程较长且需要大量实验动物，不利于 疫苗生产过程中对于各个步骤白喉类毒素含量的监测，也违背WHO关于减少动物使用量的 精神，且以上检测方法都无法大批量的对样品进行检测。因此使用白喉类毒素单克隆抗体 采用ELISA法对于白喉类毒素纯化各个步骤样品以及白喉类疫苗成品中白喉类毒素抗原 含量进行检测，将大大提高检测的准确性、特异性和工作效率，降低试验的时间成本和资金 成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是突破目前白喉疫苗生产过程各个步骤以及白喉疫苗成品中对于 类毒素抗原含量检测方法特异性差、检测效率低的缺点，提供一种效价高、均一度高、具有 良好特异性的低成本的白喉类毒素单克隆抗体，实现降低成本、提高质控的特异性和效率 的目标。 为了达到上述目的，本专利技术提供一种白喉类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保 藏编号为CGMCCNo. 10591。 本专利技术的白喉类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株于2015年5月4日在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为白喉类毒素单克隆抗体杂交 瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo. 10591。 本专利技术提供了上述杂交瘤细胞株在制备检测试剂盒中的应用。 本专利技术还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。 具体而言，本专利技术采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备抗白喉类毒素单克隆抗 体，步骤如下： (1)动物免疫：将纯化的白喉类毒素与弗式完全佐剂1:2~2:1混合并乳化；乳化 后免疫小鼠，腹腔注射，50~70yg白喉类毒素/只。 (2)加强免疫；首次免疫后两周以及四周后，对小鼠进行2次加强免疫，免疫剂量 为30~50yg白喉类毒素/只，加强免疫使用不完全佐剂。末次免疫一周后采血，采用间 接酶联免疫法检测抗体效价，如果抗体效价大于1〇 3,则进行的腹腔冲击，腹腔冲击剂量为 50~70yg白喉类毒素/只，否则继续加强免疫。 (3)取免疫后的小鼠脾脏，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:2~10:1的比 例混合，于37~39°C水浴滴加45~55%PEG4000进行细胞融合；然后缓慢加入无血清培 养基洗涤2~3次融合后的细胞，再加入完全培养基重悬，将细胞悬液100~150ul/孔加 入到细胞培养板培养，培养后添加100~150ymlHAT培养液。 (4)杂交瘤长到瓶底的50~60%以上时，ELISA法检测细胞上清中的抗体效价。 筛选出高效价的单抗细胞株，扩大培养建库，冻存。 (5)将冻存的工作种子库细胞复苏，培养到细胞覆盖瓶底的60%~100%时摇下 细胞，计数，腹腔免疫小鼠，制备腹水。 本专利技术还提供包含上述单克隆抗体的试剂盒。 所述试剂盒中，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。 进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。 进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。 本专利技术提供了上述单克隆抗体在制备检测白喉类毒素抗原试剂盒中的应用。 本专利技术提供了上述单克隆抗体在制备检测白喉类毒素抗体试剂盒中的应用。 本专利技术提供了上述保藏编号为CGMCCNo.10591的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体 在制备预防或治疗白喉类杆菌感染引起疾病的药物中的应用。 -种治疗或预防白喉类杆菌感染的药物，其含有保藏编号为CGMCCNo.10591的杂 交瘤细胞分泌的单克隆抗体。 本专利技术还提供所述单克隆抗体在检测疫苗中白喉类毒素含量的应用。 本专利技术提供了所述单克隆抗体在制备白喉类毒素疫苗中的应用。 本专利技术提供了所述单克隆抗体在白喉类毒素疫苗质量检测中的应用。 进一步地，所述的应用为单克隆抗体经生物标记或化学标记后用于检测疫苗制备 过程中或疫苗成品中的白喉类毒素抗原的含量。 进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。 进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。 本专利技术的有益效果在于：1、将白喉梭菌类毒素与佐剂处理后免疫小鼠，优于白喉类毒素直接免疫，前者可 以产生较高水平的免疫原性，满足融合需求。 2、制备的抗白喉类毒素单克隆抗体腹水，具有$父尚的效价，尚达106,未和常数为 1. 62X109M\具有优异的特异性；试验表明，该单抗可以用于白喉疫苗生产过程中各个工 序段含有白喉类毒素组份样品中白喉类毒素抗原含量的检测，也可用于白喉疫苗成品中白 喉类毒素抗原含量的测定。 本专利技术相对于现有技术具有以下优点： (1)本专利技术表明，白喉类毒素可以制备出和白喉类毒素抗原反应的特异的单克隆 抗体。 (2)制备的单抗具有较好的特异性和效价，可以用于白喉类毒素抗原的ELISA鉴 别实验，优于目前使用的多克隆抗体； (3)同时，该单抗可以用于灵敏度更高的双抗体夹心ELISA检测方法，检测各种含 有白喉类毒素抗原的样品中白喉类毒素抗原的含量，大大提高疫苗生产过程中质控的特异 性和效率，降低实验成本。【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。除非另外指明，所用试 剂、培养基、菌株、本文档来自技高网...
【技术保护点】
白喉类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.10591。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：童钦，刘一非，陈磊，雷永红，张星星，蔡芳，王治伟，张立志，高强，尹卫东，
申请(专利权)人：北京科兴中维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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