本发明专利技术涉及一种破伤风类毒素单克隆抗体及其应用，属于免疫学领域。本发明专利技术将破伤风类毒素免疫接种小鼠后，将鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选产生抗破伤风类毒素的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.10590,其分泌的单克隆抗体效价高达107，亲和常数为1.24×109M-1，可用于制备破伤风类毒素抗原检测试剂盒，也可以应用于酶联免疫法检测破伤风疫苗生产过程以及成品疫苗中类毒素的含量检测，具有广泛的应用前景与市场价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学与疫苗学领域，具体涉及一种破伤风类毒素单克隆抗体及产生 该抗体的杂交瘤细胞株以及抗体的应用。
技术介绍
破伤风是由破伤风梭菌（Clostridiumtetani)经由皮肤或黏膜伤口侵入人体，在 缺氧环境下生长繁殖，产生破伤风毒素而引起阵发性肌痉挛的一种特异性感染。破伤风是 一种感染性疾病，不是传染性疾病，不在人群中爆发流行，人与人之间不能相互感染。绝大 多数病例是由于外伤感染所致，除外伤感染外还有新生儿破伤风等。虽然破伤风的发病率 及死亡率在发达国家已显著下降，但是在大部分发展中国家仍然是一个主要的公共卫生问 题。死于破伤风的总人数中80%为新生儿，热带地区婴儿破伤风的病死率大85%。破伤风是疫苗可以预防的传染病中唯一的非传染性疾病，全球自20世纪40年代 广泛使用破伤风类毒素（TT)以来，尤其是1974年全球实施扩大免疫规划（EPI)后，破伤风 的发病率得到有效控制，发病率和死亡率明显下降。但是，破伤风带来的沉重疾病负担在发 展中国家尤其在新生儿时期依然存在，甚至在2002年，全球因新生儿破伤风死亡的人数仍 有18万。目前破伤风类毒素与白喉和无细胞百日咳疫苗组成的联合疫苗DTaP已成为许多 国家儿童联合免疫的基础。我国现有的破伤风疫苗有5类，分别是吸附精制破伤风类毒素， 吸附百日咳、白喉和破伤风类毒素混合制剂，吸附无细胞百日咳、白喉和破伤风类毒素混合 制剂，吸附精制白喉和破伤风二联类毒素，成人用吸附精制白喉和破伤风二联类毒素。破伤风梭菌产生两种外毒素，即破伤风菌溶血素和破伤风痉挛毒素。破伤风菌溶 血素是一种氧敏感的血溶素，在引起暴露部位感染的过程中发挥作用，但与发病机制无关。 破伤风痉挛毒素也称破伤风毒素，是一种能引起破伤风症状的神经毒素。通过化学方法将 破伤风毒素灭活后，制成类毒素，其仍可以保留免疫原性，是破伤风疫苗中的主要组份。破伤风类毒素是破伤风疫苗中的主要活性成分。目前《中华人民共和国药典》2010 年版三部中对于破伤风疫苗中破伤风类毒素抗原含量的测定主要包括絮状单位试验、蛋白 氮含量测定、SDS-PAGE纯度测定以及效价测定。其中，由于絮状单位试验的结果判定采用 观察法，且试验结果受反应时间和环境温度影响很大，试验结果的准确性和精确性较差；蛋 白氮含量检测通过蛋白氮含量间接推断破伤风类毒素含量，检测结果准确性与破伤风类毒 素纯度密切相关，受杂质影响较大，精确度和准确度较差；SDS-PAGE法主要用来做对破伤 风类毒素的鉴别和定性，无法准确的定量，而效价实验步骤复杂、过程较长且需要大量实验 动物，不利于疫苗生产过程中对于各个步骤破伤风类毒素含量的监测，也违背WHO关于减 少动物使用量的精神，且以上检测方法都无法大批量的对样品进行检测。因此使用破伤风 类毒素单克隆抗体采用ELISA法对于破伤风类毒素纯化各个步骤样品以及破伤风类疫苗 成品中破伤风类毒素抗原含量进行检测，将大大提高检测的准确性、特异性和工作效率，降 低试验的时间成本和资金成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是突破目前破伤风疫苗生产过程各个步骤以及成品中对于类毒素 抗原含量检测方法特异性差、检测效率低的缺点；提供一种一致性好、效价高、均一度高、具 有良好特异性的低成本的抗破伤风类毒素单克隆抗体，实现降低成本、提高质控的特异性 和效率的目标。 为了达到上述目的，本专利技术提供一种破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其 保藏编号为CGMCCNo. 10590。 该杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，地址北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo. 10590， 保藏日期2015年5月4日，分类命名为：破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株。 本专利技术提供了上述杂交瘤细胞株在制备检测试剂盒中的应用。 本专利技术还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。 具体而言，本专利技术采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备抗破伤风类毒素单克隆抗 体，步骤如下： (1)动物免疫：将纯化的破伤风类毒素与弗式完全佐剂1:2~2:1混合并乳化；乳 化后免疫小鼠，腹腔注射，50~70yg破伤风类毒素/只。 (2)加强免疫；首次免疫后两周以及四周后，对小鼠进行2次加强免疫，免疫剂量 为30~50yg破伤风类毒素/只，加强免疫使用不完全佐剂。末次免疫一周后采血，采用 间接酶联免疫法检测抗体效价，如果抗体效价大于1〇 3,则进行的腹腔冲击，腹腔冲击剂量 为50~70yg破伤风类毒素/只，否则继续加强免疫。 (3)取免疫后的小鼠脾脏，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:2~10:1的比 例混合，于37~39°C水浴滴加45%~55%PEG4000进行细胞融合；然后缓慢加入无血清 培养基洗涤2~3次融合后的细胞，再加入完全培养基重悬，将细胞悬液100~150ul/孔 加入到细胞培养板培养，培养后添加100~150ymlHAT培养液。 (4)杂交瘤长到瓶底的50%~60%以上时，ELISA法检测细胞上清中的抗体效价。 筛选出高效价的单抗细胞株，扩大培养建库，冻存。 (5)将冻存的工作种子库细胞复苏，培养到细胞覆盖瓶底的60%~100%时摇下 细胞，计数，腹腔免疫小鼠，制备腹水。 本专利技术还提供包含上述单克隆抗体的试剂盒。 所述试剂盒中，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。 进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。 进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。 本专利技术提供了上述单克隆抗体在制备检测破伤风类毒素抗原试剂盒中的应用。 本专利技术提供了上述单克隆抗体在制备检测破伤风类毒素抗体试剂盒中的应用。 本专利技术提供了上述保藏编号为CGMCCNo. 10590的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体 在制备预防或治疗破伤风梭菌感染药物中的应用。 -种治疗或预防破伤风梭菌感染引起疾病的药物，其含有保藏编号为CGMCC No. 10590的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。 本专利技术还提供所述单克隆抗体在检测疫苗中破伤风类毒素含量的应用。 本专利技术提供了所述单克隆抗体在制备破伤风类毒素疫苗中的应用。 本专利技术提供了所述单克隆抗体在破伤风类毒素疫苗质量检测中的应用。 进一步地，所述的应用为单克隆抗体经生物标记或化学标记后用于检测疫苗制备 过程中或疫苗成品中的破伤风类毒素抗原的含量。 进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。 进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。 本专利技术的关键点在于： 1、将破伤风梭菌类毒素与佐剂处理后免疫小鼠，优于破伤风类毒素直接免疫，前 者可以产生较高水平的免疫原性，满足融合需求。 2、制备的抗破伤风类毒素单克隆抗体腹水，具有较高的效价，腹水效价为10 6,较 好的特异性，亲和常数为1. 24X109M\可以用于破伤风类毒素抗原的ELISA鉴别实验，优 于目前使用的多克隆抗体；该单抗可以用于灵敏度更高的双抗体夹心ELISA检测方法，检 测各种含有破伤风类毒素抗原的样品中破伤风类毒素抗原的含量，大大提高疫苗生产过程 中质控的特异性和效率，降低实验本文档来自技高网...
【技术保护点】
破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.10590。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘一非，陈磊，童钦，朱朗，张星星，蔡芳，王治伟，张立志，高强，尹卫东，
申请(专利权)人：北京科兴中维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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