本发明专利技术适用于生物技术以及医学领域，提供了用于人类ALDH2基因多态性检测的特异性引物和试剂盒，其中所述试剂盒包括特异性引物，特异性探针，内标系统，Taq酶，UNG酶。本发明专利技术所提供的用于检测ALDH2基因多态性的引物和试剂盒具有特异性强、敏感度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体的，涉及一种人类ALDH2基因多态性检测特异性 引物和试剂盒。
技术介绍
人类乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH)是一种催化乙醛以及其他脂肪 族醛氧化的四联体蛋白酶。目前，已发现有19种ALDH同工酶，研宄较为深入的主要有胞 质同工酶ALDHl和线粒体同工酶ALDH2,其中ALDH2在肝脏和胃中具有很高的表达量，是人 体乙醇代谢途径中关键酶之一。 人类ALDH2基因位于人类第12号染色体的12q24. 2,总长约44kb，含有13个外 显子，编码有517个氨基酸残基的多肽，目前发现存在His47Arg、Glu479Lys、Glu504Lys 等多种突变体，其中主要突变体是Glu504Lys(rs671)，即位于12号外显子的单碱基突变 G1510A。正常的等位基因记为ALDH2*1 (*1510G)，突变的等位基因记为ALDH2*2 (*1510A)。 ALDH2*2在人类各族群中的分布是不同的，研宄显示中国人ALDH2*2的频率为16 %，日本人 24%，泰国人5%，韩国人15%，印度人2%，但在白种人与黑人人群中频率很低，甚至完全 缺乏。研宄显示，突变型等位基因 ALDH2*2的乙醛脱氢酶活性及硝酸酯酶活性基本丧失。 ALDH2*2/*2纯合突变型乙醛脱氢酶活性约为ALDH2*1野生型的2%，ALDH2*l/*2 杂合突变型乙醛脱氢酶活性约为ALDH2*1野生型的13-14%。突变型基因 ALDH2*2的存在与 酒精性中毒、酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD)、消化道癌症等疾病有关。研宄 显示，携带ALDH2*2突变基因型者大量饮酒将显著增加患肝癌的危险性。在饮酒人群中，尤 其是重度饮酒者，由于其上消化道长期地与大量酒精直接接触，该区域出现癌变（食道癌、 口咽癌等）的几率较高。此外，ALDH2*2显性突变与胃癌的易感性也存在一定的联系。研 宄显示，ALDH2*2突变人群患肝癌、食道癌、口腔癌的概率分别是ALDH2*1野生人群的3倍、 12. 95倍、11. 72倍以上。 ALDH2同时也是硝酸甘油有效代谢物NO形成的关键，ALDH2*2突变会导致硝酸酯 酶活性降低，使得硝酸甘油在体内生物转化过程受阻，有效活性产物NO生成减少，进而导 致硝酸甘油治疗心绞痛效果降低。研宄表明，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治疗心绞痛 的疗效明显优于ALDH2*2患者，野生型ALDH2对硝酸甘油的催化活性（Vmax/Km)大约是突 变型的10倍，且前者迅速起效率也明显高于后者。ALDH2*2/*2纯合突变型硝酸酯酶活性约 为ALDH2*1野生型的6-7%，ALDH2*l/*2杂合突变型硝酸酯酶活性约为ALDH2*1野生型的 8-15%。同时，ALDH2突变基因携带者服用硝酸甘油无效风险也在大幅增加，ALDH2纯合及 杂合突变型使用无效率达到42. 4%，大约为ALDH2野生型的3倍。ALDH2基因多态性如表 1所示。 表1 :ALDH2基因多态性 目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶 解曲线检测法（High Resolution Melting Analysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常 见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备 要求比较特殊，临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但 该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态 性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种 快速有效的检测少量样本的ALDH2基因多态性的方法。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种人类ALDH2基因多 态性检测特异性引物和试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多 态性检测效果不理想的问题。 本专利技术提供了一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物，其中，正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。 本专利技术还提供了一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒含有本专利技术 所述的特异性引物。 所述试剂盒还包括一组如SEQ ID NO. 3与SEQ ID NO. 4荧光定量PCR探针序列， 且所述荧光定量PCR探针的5'端有FAM或VIC修饰，3'端有NFQ-MGB修饰。 试剂盒采用Taqman探针法，建立了在同一反应管检测同一基因两种不同多态性 的多重荧光定量PCR检测方法，通过能特异性识别野生型和突变型模板的探针序列，有效 区分同一基因的两种多态性，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定地 对样品进行分型检测。本专利技术的试剂盒具有以下优点：1.可以准确检测单个样品的基因 型；2.可以准确检测Ing基因组DNA的基因型；3.针对ALDH2的基因型设计SNP分型探针， 可以特异性扩增识别对应基因的多态性；4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均 为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5.在同一反 应管中检测同一基因两种多态性，操作简便，能在90分钟内完成检测，且结果判读方法简 单客观，便于分析。【附图说明】 图1为ALDH2*1/*1纯合野生样本43例检测结果； 图2为ALDH2*l/*2杂合突变样本16例检测结果； 图3为ALDH2*2/*2纯合突变样本1例检测结果； 图4为ALDH2*1/*1纯合野生样本40例检测结果； 图5为ALDH2*l/*2杂合突变样本9例检测结果； 图6为ALDH2*2/*2纯合突变样本1例检测结果。【具体实施方式】 为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅仅用以 解释本专利技术，并不限定本专利技术。 本专利技术的一个方面提供了一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物，其中，正 向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。 本专利技术还提供了一种用于人类ALDH2基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括 PCR缓冲液，1组特异性引物，1组荧光定量PCR探针和内标系统，Hot Start Taq酶，UNG酶。 所述特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 2所示。扩增包含ALDH2*1和ALDH2*2基因多态性的DNA片段。 ALDH2*1 上游引物 5' -TTGGAGCCCAGTCAC-3' SEQ ID N0:1 ALDH2*2 下游引物 5' -CCTCAAGCCCCAAC-3' SEQ ID N0:2 在本专利技术的一种实施方式中，所述PCR缓冲液中含有1. 0~5. OmM的MgCl2,1. 0~ 5. OmM 的 dNTPs，即 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP 各 L 0 ~5. OmM。 所述荧光定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物，其特征在于，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周鹏飞，蔡从利，张喆，王雯静，薛伟沧，李丽琼，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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