本发明专利技术公开了一种三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和用途。本发明专利技术所述试纸条由样品结合垫、层析膜、吸水垫和粘性底衬组成。本发明专利技术基于抗原抗体的免疫学原理检测牛奶中的三聚氰胺污染。本研究提供的三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条可以用于三聚氰胺的现场快速检测，只需10min；与荧光检测仪连用，可实现定量检测；操作者不需要专业培训，因此将具有良好的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及牛奶中H聚氯胺污染的检测技术，具体涉及一种H聚氯胺英光微球免 疫层析试纸条及其制备方法和用途。
技术介绍
H聚氯胺简称H胺，化学名1，3, 5-H嗦-2, 4, 6-H氨，分子式为〔3成&，相对分子 质量为126. 12,是一种低毒无味的纯白色单斜棱晶体，广泛应用于涂料、建材、造纸、皮革、 纺织等行业中。由于H聚氯胺的含氮量高达66%，是蛋白质平均含氮量的4倍，而常用的 凯氏定氮法测定样品中的蛋白质含量时却不能区分该种非蛋白氮，因此被不法商贩利用添 加在饲料和食品中W提高食品和饲料中粗蛋白质检测数值。动物实验表明，H聚氯胺对于 哺乳动物属于微毒、低毒类化学物质，长期饲喂可能造成生殖、泌尿系统的损害，膀脫、肾部 出现结石，并可进一步诱发膀脫癌。联合国负责食品安全标准的机构国际食品法典委员会 2010年7月6日表示，该委员会已就食品中H聚氯胺的允许含量设立了新标准。新标准规 定，每千克婴儿配方奶粉中的H聚氯胺含量不能超过Img，而每千克其他食品或动物饲料中 的H聚氯胺含量不能超过2. 5mg。因此，加强对H聚氯胺检测技术的研究和快速检测技术的 发展是非常有必要的。目前，检测H聚氯胺比较经典的方法有高效液相色谱法（HPLC)、液相色谱-质谱/ 质谱法（LC-MS/MS)、气相色谱-质谱联用法（GC-MS)等，该些都是比较传统的方法，也是目 前的确证方法。另外，目前常用的还有酶联免疫法（ELISA)。但由于W上方法均需先进检测 仪器，检测费用昂贵、步骤繁琐耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用于基层企事业 单位的大通量快速筛查检测。胶体金免疫层析法具有检测速度快、价格便宜、操作简单等优 点，是目前国内外检测H聚氯胺的主要监控方法，但仍存在一些缺陷，如稳定性较差、灵敏 度较低、无法实现定量检测、基质效应明显背景干扰大，且颜色单一，难W实现多检和联检。英光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在英光染料标记技术上发展 起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结 合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。但是相比胶体金等传统标记 物，英光微球的发光强度可W随激发光的强度增强而增强，所W英光微球标记有望提高免 疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，英光微球具有相对稳定的形态结构，粒度 均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；且形成微球后 染料英光巧灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此相比上 述检测方法，英光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种操作简单、携带方便且制备 成本低、可快速检测H聚氯胺污染的H聚氯胺英光微球免疫层析试纸条。 本专利技术的另一个目的是提供上述H聚氯胺英光微球免疫层析试纸条的制备方法。 本专利技术的另一个目的是提供上述H聚氯胺英光微球免疫层析试纸条在检测牛奶 中H聚氯胺污染的应用。 本专利技术的上述目的是通过如下方案实现的： -种H聚氯胺英光微球免疫层析试纸条，由样品结合垫、层析膜、吸水垫、粘性底 衬组成，粘性底衬上依次粘贴样品结合垫、层析膜和吸水垫；所述层析膜上依次包被有H聚 氯胺半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体，聚氯胺半抗原-载体蛋白偶联物所在 区域为测试线，W羊抗鼠抗抗体所在区域为质控线；所述样品结合垫包埋有英光微球标记 的抗H聚氯胺单克隆抗体，所述英光微球是内部包埋英光染料、表面修饰有駿基官能团的 微球息液，英光微球由聚苯己帰包被，粒径100~300nm，固体含量1%~10%，官能团密度 100 ~600uEq/g。 H聚氯胺英光微球免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤： 1)制备H聚氯胺单克隆抗体； 2)制备英光微球标记的抗H聚氯胺单克隆抗体，并将其包埋在样品结合垫上； 3)将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在粘性底衬上，切割、组装试纸 条，用于检测H聚氯胺。 具体地说，步骤包括： 1)将H聚氯酸二醜胺与邻苯二甲酸酢反应，制备H聚氯胺半抗原； 2)将H聚氯胺半抗原与载体蛋白偶联，制备H聚氯胺半抗原-载体蛋白偶联物； 3)用H聚氯胺半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细 胞通过融合、筛选，得到分泌H聚氯胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株； 4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体； 5)将样品结合垫用含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0.5% 体积百分含量)、抑7. 2、0.1mol/L的磯酸盐缓冲液均匀浸泡化，37C下烘干化； 6)通过邸C和N服介导的与蛋白表面氨基的醜胺化反应完成英光微球标记抗H聚 氯胺单克隆抗体，并将其W特定缓冲体系稀释后，将5)处理过的样品结合垫浸泡于稀释缓 冲液中，经真空冷冻干燥后备用； 7)将H聚氯胺半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体分别包被在层析膜上， H聚氯胺半抗原-载体蛋白偶联物所在区域作为测试线，羊抗鼠抗抗体所在区域作为质控 线； 8)将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在粘性底衬上，切割、组装试纸 条，用于检测H聚氯胺。 所述的英光微球-抗H聚氯胺抗体偶联物是通过邸C和N服介导的与蛋白表面氨 基的醜胺化反应完成英光微球标记抗H聚氯胺单克隆抗体，制备方法如下： 英光微球-抗H聚氯胺抗体偶联物的制备；取内部包埋英光染料、表面修饰有駿 基官能团的微球息液lOOyL混息于900UL活化缓冲液（P册.5~6. 5的0.05mol/L的 2-(N-吗啡晰）己賴酸溶液冲，1000化/min于4°C离也lOmin弃上清，重息微球于1血活化 缓冲液中，W此法洗涂微球2次，加入适量活化剂，混匀后室温振荡活化lOmin;混息液于4°C10000r/min离也lOmin弃上 清，重息于偶联缓冲液（pH7. 5~8. 50. 05mol/L测酸盐缓冲液)中，W此法洗涂微球2次，加 入15~30yLH聚氯胺单克隆抗体溶液(蛋白浓度Img/mL)，混匀后室温振荡偶联120min;混息液于4°C1000化/min离也lOmin弃上清，重息于封闭缓冲液中，W此法 洗涂微球1次，混匀后室温振荡封闭30min;混息液于4°C1000化/min离也lOmin弃上清， 重息于胆存缓冲液 中，W此法洗涂微球1次，混匀后于4°C避光保存。 所述英光微球-抗H聚氯胺抗体偶联物中的H聚氯胺单克隆抗体是聚氯胺 半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。 所述H聚氯胺半抗原-载体蛋白偶联物是由H聚氯胺半抗原与载体蛋白偶联得 至IJ，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白。具 体步骤如下： 取H聚氯胺半抗原12. 3mg，用2血水溶解；取碳化二亚胺（邸C)和N-羟基玻巧醜 亚胺（N服）各20mg，用0. 5mL当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条，由样品结合垫、层析膜、吸水垫、粘性底衬组成，粘性底衬上依次粘贴样品结合垫、层析膜和吸水垫，其特征在于，所述层析膜上依次包被有三聚氰胺半抗原‑载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体，以三聚氰胺半抗原‑载体蛋白偶联物所在区域为测试线，以羊抗鼠抗抗体所在区域为质控线；所述样品结合垫包埋有荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯才伟，何方洋，万宇平，冯静，杨昌松，崔廷婷，崔彦虎，魏力杰，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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