用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，该试剂盒包括脂肪保存液、脂肪洗涤液、脂肪分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液；脂肪保存液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；脂肪洗涤液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks或HBS；脂肪分解液为含胶原酶I0.75～2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培养基；细胞洗涤液为PBS、D-Hanks或HBSS；细胞培养液为间充质干细胞无血清生长培养基；细胞消化液为含Trypsin-EDTA1.25～2.5mg/ml的PBS、D-Hanks或HBSS溶液；细胞冻存液为含DMSO60～200mg/ml的间充质干细胞无血清生长培养基。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
本专利技术属于干细胞
，涉及一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。
技术介绍
2001年，Zuk等发现在脂肪组织存在一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪间充质干细胞，简称脂肪干细胞。其生物学性质与骨髓间充质干细胞相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景，因此脂肪间充质干细胞已成为干细胞领域备受关注的热点。2012年I月，韩国FDA批准的自体脂肪干细胞药物Cuepistem成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月，美国FDA批准了 Cytori Therapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。脂肪间充质干细胞具有广阔的临床应用前景。因此，开发简单、快速、高新、安全获得大量脂肪间充质干细胞方法成为当务之急，而目前现有技术中还未有用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，使得相关科研工作进展缓慢。
技术实现思路
本专利技术目的是为了弥补现有技术中存在的不足，提供一种使用方便，成本低廉的用于制备获得大量脂肪间充质干细胞的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是:一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，包括脂肪保存液、脂肪洗涤液、脂肪分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液； 所述脂肪保存液为含青霉素100?200ug/ml、链霉素100?200ug/ml、两性霉素2.5?5 μ g/ml 的 DMEM、DMEM/F12、MEM 或 RPM1-1640 培养基； 所述脂肪洗涤液为含青霉素100?200ug/ml、链霉素100?200ug/ml、两性霉素2.5?5 μ g/ml 的生理盐水、PBS、D-Hanks 或 HBS ； 所述脂肪分解液为含胶原酶I 0.75?2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPM1-1640培养基; 所述细胞洗涤液为PBS、D-Hanks或HBSS ； 所述细胞培养液为间充质干细胞无血清生长培养基，该培养基由无血清基础培养基450ml及其添加物50ml组成，化学成分限定，含L-谷氨酰胺，不含酚红和抗生素； 所述细胞消化液为含Trypsin-EDTA 1.25?2.5mg/ml的PBS、D-Hanks或HBSS溶液； 所述细胞冻存液为含DMSO 60?200mg/ml的间充质干细胞无血清生长培养基。本专利技术提供了一种制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。该试剂盒中，脂肪保存液的作用是保证脂肪标本在采集之后的运输过程中的活性，并消灭和预防细菌、真菌。脂肪洗涤液的作用是洗涤除去脂肪组织的血液细胞，同时消灭和预防细菌、真菌。脂肪分解液的作用是消化脂肪组织，获得单细胞悬液。细胞洗涤液的作用是洗涤获得的干细胞。细胞培养液为无血清生长培养基，且化学成分限定，减少动物来源的病原体感染风险，培养脂肪间充质干细胞相对于使用胎牛血清而言更安全。细胞消化液的作用是细胞传代时，消化贴壁的间充质干细胞。细胞冻存液的作用是冻存获得的脂肪间充质干细胞。本专利技术的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，可在较短时间(3周内)获得大量脂肪间充质干细胞(细胞数量可达19数量级)，并且具有使用方便，成本低廉，无血清，减少动物来源的病原体感染风险，更安全的特点，将在干细胞临床试验及其相关研究中发挥重要作用，应用前景极为广泛。【具体实施方式】下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所需试剂耗材及实验仪器等均可通过商业途径购得。实施例一用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备及应用一、用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒的制备 1、溶液配置 本专利技术的用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂: (I)脂肪保存液配置方法:青霉素(品牌Amresco，货号0242 ) 200mg、链霉素(品牌Amresco，货号 0382) 200mg、两性霉素(品牌 Amresco，货号 E437) 5mg，溶于 1000ml DMEM 培养基中0.22um过滤除菌即可。(2)脂肪洗涤液配置方法:青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg，溶于100ml生理盐水中0.22um过滤除菌即可。(3)脂肪分解液配置方法:胶原酶1(品牌sigma，货号C0130)l g溶于1000ml DMEM培养基中，0.22um滤器过滤除菌即可。(4)细胞洗涤液配置方法:PBS，配方为 NaCl 8.50g，Na2HPO4.12H20 3.58g，NaH2PO4.2H20 0.39g，加双蒸水至1000ml，调整pH至7.2-7.4之间，高压灭菌即可。(5)细胞培养液配置方法:无血清基础培养基(品牌Lonza，货号00190620) 450ml及其添加物(品牌Lonza，货号00192125) 50ml混匀即可。(6)细胞消化液配置方法:Trypsin (胰蛋白酶)0.25g，EDTA_2Na 19.728mg溶于上述配好的细胞洗涤液即PBS 10ml中，混匀，0.22um滤器过滤除菌即可。(7)细胞冻存液配置方法:10ml DMSO (品牌sigma，货号D2650)缓慢加入到90ml上述配好的细胞培养液即间充质干细胞无血清生长培养基中，轻轻混匀即可。2、各组分的分装 试剂盒的规格为I次/盒，每盒中各组分的量为:脂肪保存液I瓶(50ml/瓶)，脂肪洗涤液I瓶(250ml/瓶)，脂肪分解液I瓶(50ml/瓶)，细胞洗涤液3瓶(250ml/瓶)，细胞培养液4瓶(250ml/瓶)，细胞消化液I瓶(50ml/瓶)，细胞冻存液I瓶(50ml/瓶)。按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20 V保存，有效期2年，使用之前4 V冰箱内或者37 °C水浴解冻，解冻之后4°C保存，一个月内用完。二、脂肪间充质干细胞的制备 现用步骤一的试剂盒制备脂肪间充质干细胞，具体制备方法包括以下步骤，以20ml脂肪为例，所有操纵步骤均在洁净工作台完成: 1、脂肪运输:采集20ml脂肪，加入等体积的脂肪保存液，2?8°C恒温保存在疫苗箱中，48h内送至实验室。2、洗涤脂肪:吸弃脂肪保存液，加入等体积脂肪洗涤液，反复振荡几次，静置后脂肪与脂肪洗涤液自然分层，吸弃脂肪洗涤液，同上，再加入等体积脂肪洗涤液振荡洗涤2?3次，至下层脂肪洗涤液澄清即可，吸弃脂肪洗涤液，获得脂肪。3、消化脂肪:获得的脂肪加入等体积的脂肪分解液(预热到37°C)，置于恒温振荡培养箱中，37°C，200rpm，消化30?60min，至脂肪呈靡状即可。4、分离SVF (基质血管部分):将消化后的靡状脂肪组织，700g离心lOmin，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液(注意在SVF沉淀上方留下少量的溶液以免扰动沉淀细胞)，加入细胞洗涤液混匀，10um滤网过滤，吸取Iml悬液计数，为2.1 X 17个,400g离心8min,弃上清,获得SVF。5、细胞种植:根据SVF细胞数，按照1.0父106个/ ml的密度加入细胞培养液20ml,接种I个T175培养瓶,置于二氧化碳培养箱,培养条件:37±0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒，其特征在于：包括脂肪保存液、脂肪洗涤液、脂肪分解液、细胞洗涤液、细胞培养液、细胞消化液、细胞冻存液；    所述脂肪保存液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI‑1640培养基；所述脂肪洗涤液为含青霉素100～200ug/ml、链霉素100～200ug/ml、两性霉素2.5～5μg/ml的生理盐水、PBS、D‑Hanks或HBS；所述脂肪分解液为含胶原酶I 0.75～2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI‑1640培养基；所述细胞洗涤液为PBS、D‑Hanks或HBSS；所述细胞培养液为间充质干细胞无血清生长培养基，该培养基由无血清基础培养基450ml及其添加物50ml组成；所述细胞消化液为含Trypsin‑EDTA 1.25～2.5mg/ml的PBS、D‑Hanks或HBSS溶液；所述细胞冻存液为含DMSO 60～200mg/ml的间充质干细胞无血清生长培养基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张炳强，许评，尹桂萍，崔冰，王彩云，史光军，
申请(专利权)人：青岛中天干细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37