稻瘟病抗性基因Pi50及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种稻瘟病抗性基因Pi50及其制备方法与应用。该稻瘟病抗性基因Pi50的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。可通过化学合成方法得到该稻瘟病抗性基因Pi50；或是设计引物，以EBZ基因组DNA为模板，PCR扩增得到该稻瘟病抗性基因Pi50。该稻瘟病抗性基因Pi50具有优异的抗病性，能用于选育对稻瘟病具有抗病性的水稻。

【技术实现步骤摘要】
稻瘟病抗性基因Pi50及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种稻瘟病抗性基因，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi50及其制备方法与应用。
技术介绍
水稻是最重要的粮食作物之一，全球约有一半以上的人口以稻米为主食，而稻瘟病菌(Magnapotheoryzae)引起的稻瘟病对水稻的安全生产造成严重的危害，每年都造成严重的粮食损失。从农业可持续发展的观点来看，选育和利用抗病品种是防治稻瘟病的最有效、最安全环保的方法，然而稻瘟病菌群体的多样性及易变性，以及人们缺乏对抗性基因的充分了解和有效利用，导致单一抗病品种抗性的短命化(通常仅2-4年)，而成为育种学家最为棘手的问题(郑钊等2009)。因此合理挖掘、克隆和利用广谱抗病基因，是获得持久、广谱抗病品种的重要途径，已成为农业科研中优先解决的重要问题。迄今，人们已经鉴定出80多个水稻稻瘟病抗性基因(Ballinietal.,2008；鄂志国等2009；Jiangetal.,2012)，至少22个抗瘟基因已被克隆(Wangetal.,1999；Quetal.,2006；Hayashietal.,2010；Jiangetal.,2012；Huaetal.,2012；Dasetal.,2012)。研究表明，这些抗瘟基因多数是具有核苷酸结合位点-富亮氨酸重复结构(NBS-LRR)的蛋白质，即N-端存在核苷酸结合位点(nucleotidebindingsite,NBS)，C-端存在富亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat,LRR)。NBS结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack&Jones1997)，NBS具有结合ATP或GTP以及水解酶的活性，可以激活激酶或G蛋白(Trautetal.,1994)；LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质的相互作用(Jones&Jones,1996；Dangl&Jones,2001；Takken&Tameling,2009；Bernoux,2011)，推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互作用的部位(Bent,1996；Bakeretal.,1997)。Jiaetal.(2000))。通过酵母双杂交证明AVR-Pita编码的激发子与Pita受体LRD区域的结合，能激活细胞内Pita介导的防卫反应，直接证明了LRR结构域可能就是病原菌识别的区域。NBS-LRR基因有成簇排列的倾向，通常簇内基因的同源性很高，与相同抗性途径的基因也维持着共遗传的规律(Michelmore&Meyers,1998；Leister,2004)。水稻第6染色体长臂的Pi2/9基因簇是科学家的研究热点，从该位点区域已报道并深入研究的抗瘟基因有：Pi2、Pi9、Pigm(t)、Pi-z及Piz-t，他们分布在2-9个NBS-LRR成员组成的基因簇内。人们证明了Pi2、Pi9和Pi-z中单个NBS-LRR基因具有广谱抗瘟作用(Zhou，2006，2007；Dai，2010)，其中，Pi2和Piz-t的LRR区域仅8个氨基酸残基的差异就产生了不同的产物及抗性(Quetal.,2006；Zhouetal.,2006)。而其中更多的NBS-LRR抗病基因正在被进一步的挖掘和利用，该基因簇的应用前景可观。对于该区域抗病基因的克隆以及充分的认识，可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害，也是了解水稻抗稻瘟病基因成簇机制的前提。同时，可能通过对基因关键位点的修饰和改造，拓宽植物的抗谱，或者进行更精确地靶向育种。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种稻瘟病抗性基因Pi50。本专利技术的另一目的在于提供所述稻瘟病抗性基因Pi50的制备方法与应用。本专利技术的再一目的在于提供所述稻瘟病抗性基因Pi50的编码蛋白。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种稻瘟病抗性基因Pi50，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：所述的稻瘟病抗性基因Pi50的长度为3099个核苷酸，能编码1032个氨基酸的蛋白质；所述的稻瘟病抗性基因Pi50的制备方法，可通过化学合成方法得到，或是设计引物，以EBZ基因组DNA为模板，PCR扩增得到；所述的稻瘟病抗性基因Pi50的应用，可将其用于选育对稻瘟病具有抗病性的水稻；具体步骤如下：将稻瘟病抗性基因Pi50转入易感病的水稻中，得到具有抗病性的水稻；所述的稻瘟病抗性基因Pi50编码的蛋白序列如SEQIDNO.2所示。所述的稻瘟病抗性基因Pi50编码的蛋白序列共计1032个氨基酸，包含2个主要的结构域：NBS和LRR区域，其中包括含有保守的AAAkinase结构域的NBS区域(170-462aa)，以及C-末端的富亮氨酸的LRR重复区域(578-1032aa)，其亮氨酸含量(67of454)为14.8％。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术提供的稻瘟病抗性基因Pi50转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克隆是克服传统育种中难以在植物种间转移抗病基因的问题的前提。本专利技术能够进一步提供或应用基于上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本专利技术的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以通过有性杂交的方式将本专利技术的基因转入其他的植株中。附图说明图1是Pi2/9等位基因对稻瘟病菌群体抗谱的比较图。图2是水稻稻瘟病抗性基因Pi50的克隆策略图。图3是通过PCR鉴定转化体的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1和12为分子量标记1kbladder、泳道2为pCambia-Pi50-N4质粒为模板得到的PCR产物、泳道3为转化受体品种日本晴基因组DNA为模板得到的PCR产物、泳道4为EBZ基因组DNA为模板得到的PCR产物、泳道5-11为不同的T0转化体基因组DNA为模板得到的PCR产物。图4是水稻对照品种和pCambia-Pi50阳性转化体接种稻瘟病病原菌TY19七天后的结果图；其中，自左向右，第1条叶片是感病品种日本晴、第2条叶片是水稻抗病品种EBZ，第3～6条叶片是pCambia-Pi50阳性转化个体，第7条叶片是抗性品种IRBLzt-T，第8条叶片是抗性品种IRBLz5-CA。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在本专利技术的实施例部分，阐述了Pi50基因的抗性特征、分离克隆、功能特征以及分子鉴定，分离的Pi50基因能够与适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性。本实验室的前期工作如下(参见Zhu,etal.TheidentificationofPi50(t),anewmemberofthericeblastresistancePi2/Pi9multigenefamily.TheorApplGenet,2012(124):1295-1304)：(1)抗性基因Pi50的抗性特征为了比较和明确Pi50与Pi2/9位点4个等位基因(Pi2,Pi9,Piz,Piz-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稻瘟病抗性基因Pi50，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因Pi50的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病抗性基因Pi50，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因Pi50的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50的制备方法，其特征在于通过如下步骤得到：通过化学合成方法得到；或是设计引物，以EBZ基因组DNA为模板，PCR扩增得到。3.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏菁，朱小源，陈深，汪文娟，汪聪颖，曾列先，杨健源，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44